वसा ऊतक-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (विज्ञापन-एमएससी) एमएससी का एक संभावित स्रोत हो सकता है जो इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) में अंतर करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे के एपिडिडिमल विज्ञापन-एमएससी के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत कदम प्रदान करते हैं, इसके बाद एक ही चूहे विज्ञापन-एमएससी से आईपीसी की पीढ़ी के लिए एक सरल, लघु प्रोटोकॉल होता है।
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) – विशेष रूप से वसा ऊतक (विज्ञापन-एमएससी) से अलग-थलग लोगों ने स्टेम कोशिकाओं के नवीकरणीय, प्रचुर मात्रा में स्रोत के रूप में विशेष ध्यान आकर्षित किया है जो किसी भी नैतिक चिंताओं को पैदा नहीं करता है। हालांकि, विज्ञापन-एमएससी को अलग करने के वर्तमान तरीके मानकीकृत नहीं हैं और जटिल प्रोटोकॉल को नियोजित करते हैं जिनके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। हमने एक सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का उपयोग करके स्प्रैग-डॉली चूहों के एपिडिडिमल वसा से विज्ञापन-एमएससी को अलग किया। पृथक विज्ञापन-एमएससी आमतौर पर अलगाव के बाद 3 दिनों के भीतर दिखाई देते हैं, क्योंकि अनुयायी कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्टिक आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं। वे कोशिकाएं अलगाव के 1 सप्ताह के भीतर 80% संगम तक पहुंच जाती हैं। इसके बाद, पारित होने पर 3-5 (पी 3-5), सीडी 90, सीडी 73 और सीडी 105 जैसे भेदभाव (सीडी) सतह मार्करों के विशेषता एमएससी क्लस्टर के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिंग द्वारा पृथक विज्ञापन-एमएससी के लिए एक पूर्ण लक्षण वर्णन किया गया था, साथ ही ऑस्टियोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंशावली के नीचे इन कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित किया गया था। यह, बदले में, पृथक कोशिकाओं की मल्टीपोटेंसी का तात्पर्य है। इसके अलावा, हमने उच्च ग्लूकोज डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (एचजी-डीएमईएम), β-मर्कैप्टोएथेनॉल, निकोटिनामाइड और एक्सेंडिन -4 को शामिल करके एक सरल, अपेक्षाकृत छोटे प्रोटोकॉल के माध्यम से इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) वंश की ओर पृथक विज्ञापन-एमएससी के भेदभाव को प्रेरित किया। आईपीसी भेदभाव का आनुवंशिक रूप से मूल्यांकन किया गया था, सबसे पहले, विशिष्ट β-सेल मार्करों जैसे माफा, एनकेएक्स 6.1, पीडीएक्स -1 और आईएनएस 1 के अभिव्यक्ति स्तर को मापने के साथ-साथ उत्पन्न आईपीसी के लिए डाइथिज़ोन धुंधला। दूसरे, मूल्यांकन ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव (जीएसआईएस) परख द्वारा कार्यात्मक रूप से भी किया गया था। अंत में, विज्ञापन-एमएससी को आसानी से अलग किया जा सकता है, सभी एमएससी लक्षण वर्णन मानदंडों का प्रदर्शन किया जा सकता है, और वे वास्तव में मधुमेह अनुसंधान के लिए प्रयोगशाला में आईपीसी का प्रचुर मात्रा में, नवीकरणीय स्रोत प्रदान कर सकते हैं।
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी), जिसे मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है, पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकारों में से हैं। उन्हें वयस्क स्टेम कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया गया है और बहुवंशीय भेदभाव क्षमता और आत्म-नवीकरण क्षमताकी विशेषता है 3. एमएससी को वसा ऊतक, अस्थि मज्जा, परिधीय रक्त, गर्भनाल ऊतक और रक्त, बालों के रोम और दांत 4,5 सहित विभिन्न स्रोतों से अलग और प्राप्तकिया जा सकता है।
वसा ऊतक से स्टेम कोशिकाओं के अलगाव को उनकी आसान पहुंच, कृत्रिम परिवेशीय में तेजी से विस्तार और उच्च उपज के कारण आकर्षक और आशाजनक दोनों के रूप में देखा जाताहै। वसा ऊतक-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (विज्ञापन-एमएससी) को विभिन्न प्रजातियों जैसे मनुष्यों, गोजातीय, चूहों, चूहों और हाल ही में, बकरियों से अलगकिया जा सकता है। यह साबित हो गया है कि विज्ञापन-एमएससी अब ऊतक इंजीनियरिंग और जीन / सेल थेरेपी के लिए संभावित उम्मीदवार हैं जिनका उपयोग नरम ऊतक की चोट या दोष 7,8 की दीर्घकालिक मरम्मत के लिए एक ऑटोलॉगस विकल्प विकसित करने के लिए भी किया जा सकता है।
इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेल एंड जीन थेरेपी (आईएससीटी) ने तीन न्यूनतम मानदंडों को परिभाषित किया है जिन्हें पूर्ण लक्षण वर्णन9 के लिए एमएससी द्वारा प्रदर्शित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, उन्हें प्लास्टिक अनुयायी होना चाहिए। दूसरा, एमएससी को सीडी 73, सीडी 9 0 और सीडी 105 जैसे मेसेनकाइमल स्टेम सेल सतह मार्करों को व्यक्त करना चाहिए और हेमटोपोइएटिक मार्करों सीडी 45, सीडी 34, सीडी 14 या सीडी 11 बी, सीडी 7 9 α या सीडी 1 9, और एचएलए-डीआर की अभिव्यक्ति की कमी है। अंत में, एमएससी को तीन मेसेनकाइमल वंशों में अंतर करने की क्षमता प्रदर्शित करनी चाहिए: एडिपोसाइट्स, ऑस्टियोसाइट्स और चोंड्रोसाइट्स। दिलचस्प बात यह है कि एमएससी अन्य वंशों जैसे न्यूरोनल कोशिकाओं, कार्डियोमायोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स और उपकला कोशिकाओं10,11 में भी अंतर कर सकते हैं।
वास्तव में, एमएससी में अद्वितीय गुण होते हैं जो उन्हें विभिन्न बीमारियों के लिए पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित चिकित्सीय एजेंटों के रूप में लागू करने में सक्षम बनाते हैं। एमएससी एक इम्यूनोमॉड्यूलेटरी वातावरण को प्रेरित करने के लिए घुलनशील कारकों का स्राव कर सकते हैं जो चिकित्सीय लाभ प्रदान करता है12. इसके अलावा, एमएससी लक्षित चिकित्सा देने के लिए चोट और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की साइटों की ओर पलायन कर सकते हैं; हालाँकि, तंत्र पूरी तरह से स्पष्ट नहीं हैं13. इसके अलावा, एमएससी में नैनोस्केल में एक्सोसोम, बाह्य पुटिकाओं को स्रावित करने की क्षमता होती है जो गैर-कोडिंग आरएनए, प्रोटीन और घुलनशील कारकों का कार्गो ले जाती है, जो हाल ही में विभिन्न बीमारियों में एमएससी की चिकित्सीय क्षमता के एक उपन्यास तंत्र के रूप में उभरीहै।
इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि एमएससी ने इंसुलिन उत्पादक कोशिकाओं (आईपीसी) में अंतर करने की उनकी क्षमता के लिए चिह्नित ध्यान दिया है, या तो आनुवंशिक संशोधन15,16 द्वारा या इन विट्रो 17 में संस्कृति मीडिया के भीतर विभिन्न बाहरी-उत्प्रेरण कारकों का उपयोग करके। आईपीसी प्रेरण अवधि बहुत भिन्न होती है, क्योंकि यह उपयोग किए गए प्रेरण प्रोटोकॉल और उपयोग किए गए बाहरी कारकों पर निर्भर करती है। भेदभाव की प्रक्रिया दिनों से महीनों तक चल सकती है, और इसके लिए बहिर्जात-उत्प्रेरण कारकों के संयोजन की आवश्यकता होती है जिन्हें विभिन्न चरणों में जोड़ा और / अंतःस्रावी अग्नाशयी भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले इनमें से कई कारक जैविक रूप से सक्रिय यौगिक हैं जिन्हें इंसुलिन-स्रावित β-कोशिकाओं के प्रसार या भेदभाव / नवजनन को बढ़ावा देने और / या आईपीसी 18,19,20,21 की इंसुलिन सामग्री को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। यहां यह उल्लेखनीय है कि एमएससी को कई तंत्रों के माध्यम से मधुमेह और इसकी जटिलताओं में चिकित्सीय प्रभाव होने की सूचना दी गई है, जिसमें उनके स्राव, साथ ही इम्यूनो-मॉड्यूलेटरी क्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला 22,23,24 शामिल है।
इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे एपिडिडिमल वसा से विज्ञापन-एमएससी के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत चरणबद्ध प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद विज्ञापन-एमएससी से आईपीसी की पीढ़ी के लिए एक सरल, अपेक्षाकृत छोटा प्रोटोकॉल होता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे एपिडिडिमल वसा से विज्ञापन-एमएससी के अलगाव और आईपीसी में इन विज्ञापन-एमएससी के भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने में कामयाब रहे। वास्तव में, चूहे एपिडीमल वसा विज्ञाप…
The authors have nothing to disclose.
हम चूहों के विच्छेदन में मदद करने के लिए डॉ रावदा समीर मोहम्मद, एमएससी, पशु चिकित्सा विशेषज्ञ, फार्मेसी संकाय, ब्रिटिश यूनिवर्सिटी ऑफ मिस्र (बीयूई) को स्वीकार करते हैं।
हम इस पांडुलिपि के वीडियो के उत्पादन और संपादन के लिए जनसंचार संकाय, मिस्र में ब्रिटिश विश्वविद्यालय (बीयूई) के प्रयासों को भी स्वीकार करना और सराहना करना चाहते हैं।
हम पांडुलिपि के संशोधन और अंग्रेजी भाषा प्रूफरीडिंग के लिए मिस फातमा मसूद, एमएससी, अंग्रेजी के सहायक व्याख्याता, मिस्र में ब्रिटिश विश्वविद्यालय (बीयूई) को धन्यवाद देना चाहते हैं।
यह काम आंशिक रूप से सेंटर फॉर ड्रग रिसर्च एंड डेवलपमेंट (सीडीआरडी), फार्मेसी संकाय, मिस्र में ब्रिटिश विश्वविद्यालय (बीयूई), काहिरा, मिस्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |