インスリン産生細胞への分化のためのラット脂肪組織間葉系幹細胞の単離
Summary
脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、インスリン産生細胞(IPC)に分化するMSCの潜在的な供給源となり得る。このプロトコルでは、ラット精巣上体Ad-MSCの単離と特性評価のための詳細な手順を提供し、続いて同じラットAd-MSCからIPCを生成するためのシンプルで短いプロトコルを提供します。
Abstract
間葉系幹細胞(MSC)、特に脂肪組織から単離されたもの(Ad-MSC)は、倫理的懸念をもたらさない再生可能で豊富な幹細胞源として特に注目されています。しかし、Ad-MSCを分離する現在の方法は標準化されておらず、特別な機器を必要とする複雑なプロトコルを採用しています。我々は、単純で再現可能な方法を用いて、Sprague-Dawleyラットの精巣上体脂肪からAd-MSCを単離した。単離されたAd-MSCは、通常、接着細胞が線維芽細胞性形態を示すため、単離後3日以内に現れる。これらの細胞は、単離後1週間以内に80%のコンフルエントに達する。その後、継代3-5(P3-5)で、CD90、CD73、およびCD105などの特徴的なMSC分化クラスター(CD)表面マーカーに対するイムノフェノタイピングによる単離Ad-MSCの完全な特性評価を行い、これらの細胞を骨形成、脂肪形成、および軟骨形成系統に分化誘導した。これは、次に、単離された細胞の多能性を意味する。さらに、我々は、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(HG-DMEM)、β-メルカプトエタノール、ニコチンアミド、およびエキセンディン-4を組み込むことによって、単純で比較的短いプロトコールを介して、単離されたAd-MSCをインスリン産生細胞(IPC)系統に向けて誘導した。IPCの分化は、まず、MafA、NKX6.1、Pdx-1、およびIns1などの特異的β細胞マーカーの発現レベルを測定すること、ならびに生成されたIPCに対するジチゾン染色を介して遺伝的に評価された。第二に、評価はグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイによっても機能的に実施された。結論として、Ad-MSCは容易に分離でき、すべてのMSC特性評価基準を示し、糖尿病研究のための実験室で豊富で再生可能なIPC源を提供することができます。
Introduction
間葉系幹細胞(MSC)は、間葉系間質細胞としても知られており、再生医療に最も広く使用されている細胞型の1つです1,2。それらは成体幹細胞に分類され、多系統分化能と自己複製能によって特徴付けられる3。MSCは、脂肪組織、骨髄、末梢血、臍帯組織および血液、毛包、および歯を含む様々な供給源から単離および得ることができる4,5。
脂肪組織からの幹細胞の単離は、その容易なアクセス、インビトロでの急速な拡大、および高収率のために、魅力的で有望であると考えられている6。脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、ヒト、ウシ、マウス、ラット、およびより最近ではヤギなどの異なる種から単離することができる7。Ad-MSCは現在、組織工学および遺伝子/細胞療法の潜在的な候補であり、軟部組織の損傷または欠損の長期修復のための自家的代替手段を開発するためにも使用できることが証明されています7,8。
国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)は、完全な特性評価のためにMSCが示さなければならない3つの最小基準を定義しています9。まず、それらはプラスチックに付着していなければなりません。第二に、MSCは、CD73、CD90、およびCD105などの間葉系幹細胞表面マーカーを発現し、造血マーカーCD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79αまたはCD19、およびHLA-DRの発現を欠いている。最後に、MSCは、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞の3つの間葉系譜に分化する能力を示すべきである。興味深いことに、MSCはまた、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、および上皮細胞などの他の系統に分化することができる10,11。
実際、MSCは、さまざまな疾患の再生治療における潜在的な治療薬として適用することを可能にするユニークな特性を持っています。MSCsは可溶性因子を分泌して、治療上の利益をもたらす免疫調節環境を誘導することができる12。さらに、MSCは、標的療法を提供するために、傷害部位および腫瘍微小環境に移行することができる。しかし、そのメカニズムは完全には解明されていない13。さらに、MSCは、エキソソーム、非コードRNA、タンパク質、および可溶性因子の積み荷を運ぶナノスケールの細胞外小胞を分泌する能力を有し、これは最近、様々な疾患におけるMSCの治療可能性の新規メカニズムとして浮上した14。
さらに重要なことに、MSCは、遺伝子改変15,16によって、またはin vitro17培養培地中の様々な外因性誘導因子を利用することによって、インスリン産生細胞(IPC)に分化する可能性について顕著な注目を集めている。IPC誘導期間は、使用される誘導プロトコルおよび使用される外因性因子に依存するため、大きく異なる。分化のプロセスは数日から数ヶ月続くことがあり、異なる段階で追加および/または撤回しなければならない外因性誘導因子の組み合わせを必要とする。内分泌膵臓分化に使用されているこれらの因子の多くは、インスリン分泌β細胞の増殖または分化/新生を促進し、および/またはIPCsのインスリン含量を増加させることが示されている生物学的に活性な化合物である18、19、20、21。MSCsは、セクレトームを含むいくつかのメカニズム、ならびに幅広い免疫調節作用を介して糖尿病およびその合併症において治療効果を有することがここでも報告されていることは注目に値する22,23,24。
このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からのAd-MSCの単離および特性評価のための詳細な段階的プロトコルを提示し、続いてAd-MSCsからのIPCの生成のための単純で比較的短いプロトコルを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からAd-MSCを単離し、これらのAd-MSCをIPCに分化するための詳細なプロトコルを提示することができました。実際、ラット精巣上体脂肪は、Ad-MSCsを得るための脂肪組織の容易に達成可能な供給源であり、収集にも処理にも特別な装置を必要としない15,26,27。単離されたAd-MSCは、優れた…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ラットの解剖を支援したエジプト英国大学(BUE)薬学部獣医師スペシャリストのRawda Samir Mohamed博士(MSc)に謝意を表します。
また、エジプトの英国大学マスコミュニケーション学部(BUE)のこの原稿のビデオの制作と編集に対する努力に感謝し、感謝したいと思います。
エジプトの英国大学(BUE)の英語アシスタント講師であるファトマ・マスード嬢に、原稿の改訂と英語の校正に感謝します。
この研究は、エジプトのカイロにあるエジプトの英国大学(BUE)の薬学部の医薬品研究開発センター(CDRD)によって部分的に資金提供されました。
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
Referências
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