Isolering av rotte fettvevsmesenchymale stamceller for differensiering i insulinproduserende celler
Summary
Fettvevsavledede mesenchymale stamceller (Ad-MSCer) kan være en potensiell kilde til MSCer som skiller seg ut i insulinproduserende celler (IPCer). I denne protokollen gir vi detaljerte trinn for isolering og karakterisering av rotte epididymale Ad-MSCer, etterfulgt av en enkel, kort protokoll for generering av IPCer fra samme rotte Ad-MSCer.
Abstract
Mesenchymale stamceller (MSCs) – spesielt de som er isolert fra fettvev (Ad-MSCs) – har fått spesiell oppmerksomhet som en fornybar, rikelig kilde til stamceller som ikke utgjør noen etiske bekymringer. Gjeldende metoder for å isolere Ad-MSCer er imidlertid ikke standardiserte og bruker kompliserte protokoller som krever spesialutstyr. Vi isolerte Ad-MSCer fra det epididymale fettet til Sprague-Dawley-rotter ved hjelp av en enkel, reproduserbar metode. De isolerte AD-MSCene vises vanligvis innen 3 dager etter isolasjon, ettersom adherentceller viser fibroblastisk morfologi. Disse cellene når 80% samløp innen 1 uke etter isolasjon. Etterpå, ved passasje 3-5 (P3-5), ble det utført en full karakterisering for de isolerte Ad-MSCene ved immunofenotyping for karakteristisk MSC-klynge av differensieringsmarkører (CD) som CD90, CD73 og CD105, samt indusere differensiering av disse cellene ned osteogene, adipogene og kondrogene avstamninger. Dette innebærer i sin tur multipotensen til de isolerte cellene. Videre induserte vi differensiering av de isolerte Ad-MSCene mot insulinproduserende celler (IPCs) avstamning via en enkel, relativt kort protokoll ved å inkorporere høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (HG-DMEM), β-mercaptoethanol, nikotinamid og exendin-4. IPCs differensiering ble genetisk vurdert, for det første, ved å måle uttrykksnivåene til spesifikke β-cellemarkører som MafA, NKX6.1, Pdx-1 og Ins1, samt dithizone farging for de genererte IPCene. For det andre ble vurderingen også utført funksjonelt av en glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS) analyse. Til slutt kan ad-MSCer enkelt isoleres, og viser alle MSC-karakteriseringskriterier, og de kan faktisk gi en rikelig, fornybar kilde til IPCer i laboratoriet for diabetesforskning.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSCer), også kjent som mesenchymale stromale celler, er blant de mest brukte celletypene for regenerativ medisin 1,2. De er klassifisert som voksne stamceller og preget av multilineage differensieringspotensial og selvfornyelseskapasitet3. MSCer kan isoleres og hentes fra ulike kilder, inkludert fettvev, benmarg, perifert blod, navlestrengsvev og blod, hårsekkene og tennene 4,5.
Isolering av stamceller fra fettvev blir sett på som både tiltalende og lovende på grunn av deres enkle tilgang, rask ekspansjon in vitro og høyt utbytte6. Fettvevsavledede mesenchymale stamceller (Ad-MSC) kan isoleres fra forskjellige arter som mennesker, storfe, mus, rotter og, mer nylig, geiter7. Det har vist seg at Ad-MSCs nå er potensielle kandidater for vevsteknikk og gen/ celleterapi som til og med kan brukes til å utvikle et autologt alternativ for langsiktig reparasjon av bløtvevsskade eller defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har definert tre minimumskriterier som må stilles ut av MSC for full karakterisering9. Først må de være plasttilhørig. For det andre bør MSCer uttrykke mesenchymale stamcelleoverflateindikatorer som CD73, CD90 og CD105 og mangle uttrykk for de hematopoietiske markørene CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 og HLA-DR. Til slutt bør MSCer vise evne til å skille seg ut i de tre mesenchymale avstamningene: adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Interessant nok kan MSCer også skille seg ut i andre avledninger som nevronceller, kardiomyocytter, hepatocytter og epitelceller10,11.
Faktisk har MSC unike egenskaper som gjør dem i stand til å bli brukt som potensielle terapeutiske midler i regenerativ terapi for forskjellige sykdommer. MSCer kan utskille løselige faktorer for å indusere et immunmodulerende miljø som gir terapeutiske fordeler12. I tillegg kan MSC migrere mot steder med skade og tumormikromiljø for å levere målrettet terapi; Mekanismene er imidlertid ikke fullt ut belyst13. I tillegg har MSC evnen til å utskille eksosomer, ekstracellulære vesikler i nanoskalaen som bærer en last med ikke-kodende RNAer, protein og løselige faktorer, som i det siste dukket opp som en ny mekanisme for MSCs terapeutiske potensial i ulike sykdommer14.
Enda viktigere er at MSC-er har generert markert oppmerksomhet for deres potensial til å skille seg ut i insulinproduserende celler (IPCer), enten ved genetisk modifikasjon15,16 eller ved å bruke ulike ekstrinsisk-induserende faktorer innen kulturmediene in vitro17. IPC-induksjonsperioden varierer sterkt, da den avhenger av den brukte induksjonsprotokollen og de brukte ekstrinsiske faktorene. Differensieringsprosessen kan vare fra dager til måneder, og det krever en kombinasjon av eksogene induserende faktorer som må legges til og / eller trekkes tilbake i forskjellige stadier. Mange av disse faktorene som har blitt brukt til endokrine pankreas differensiering er biologisk aktive forbindelser som har vist seg å fremme spredning eller differensiering / neogenese av insulin-utskillende β-celler og / eller øke insulininnholdet i IPCer 18,19,20,21. Det er bemerkelsesverdig her at MSCs også har blitt rapportert å ha terapeutiske effekter i diabetes og dets komplikasjoner via flere mekanismer, inkludert deres sekretom, samt et bredt spekter av immunmodulerende handlinger 22,23,24.
I denne protokollen presenterer vi en detaljert trinnvis protokoll for isolering og karakterisering av ad-MSCer fra rotte epididymalt fett, etterfulgt av en enkel, relativt kort protokoll for generering av IPCer fra Ad-MSCer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen klarte vi å presentere en detaljert protokoll for isolering av Ad-MSCer fra rotte epididymalt fett og differensiering av disse Ad-MSCene i IPCer. Faktisk er rotte epidydimalt fett en lett oppnåelig kilde til fettvev for å skaffe Ad-MSC og krever ikke noe spesialutstyr, verken for innsamling eller for behandling av 15,26,27. De isolerte ad-MSCene viste utmerket kulturutvidelse og viste alle kriteriene som s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, veterinærspesialist, Farmasøytisk fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE) for å hjelpe til med disseksjonen av rottene.
Vi ønsker også å anerkjenne og sette pris på innsatsen fra Fakultet for massekommunikasjon, Det britiske universitetet i Egypt (BUE) for produksjon og redigering av videoen av dette manuskriptet.
Vi vil takke Miss Fatma Masoud, MSc, assisterende foreleser i engelsk, The British University in Egypt (BUE) for revisjon og engelskspråklig korrekturlesing av manuskriptet.
Dette arbeidet ble delvis finansiert av Center for Drug Research and Development (CDRD), Det farmasøytiske fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE), Kairo, Egypt.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
Referências
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
