Fettvevsavledede mesenchymale stamceller (Ad-MSCer) kan være en potensiell kilde til MSCer som skiller seg ut i insulinproduserende celler (IPCer). I denne protokollen gir vi detaljerte trinn for isolering og karakterisering av rotte epididymale Ad-MSCer, etterfulgt av en enkel, kort protokoll for generering av IPCer fra samme rotte Ad-MSCer.
Mesenchymale stamceller (MSCs) – spesielt de som er isolert fra fettvev (Ad-MSCs) – har fått spesiell oppmerksomhet som en fornybar, rikelig kilde til stamceller som ikke utgjør noen etiske bekymringer. Gjeldende metoder for å isolere Ad-MSCer er imidlertid ikke standardiserte og bruker kompliserte protokoller som krever spesialutstyr. Vi isolerte Ad-MSCer fra det epididymale fettet til Sprague-Dawley-rotter ved hjelp av en enkel, reproduserbar metode. De isolerte AD-MSCene vises vanligvis innen 3 dager etter isolasjon, ettersom adherentceller viser fibroblastisk morfologi. Disse cellene når 80% samløp innen 1 uke etter isolasjon. Etterpå, ved passasje 3-5 (P3-5), ble det utført en full karakterisering for de isolerte Ad-MSCene ved immunofenotyping for karakteristisk MSC-klynge av differensieringsmarkører (CD) som CD90, CD73 og CD105, samt indusere differensiering av disse cellene ned osteogene, adipogene og kondrogene avstamninger. Dette innebærer i sin tur multipotensen til de isolerte cellene. Videre induserte vi differensiering av de isolerte Ad-MSCene mot insulinproduserende celler (IPCs) avstamning via en enkel, relativt kort protokoll ved å inkorporere høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (HG-DMEM), β-mercaptoethanol, nikotinamid og exendin-4. IPCs differensiering ble genetisk vurdert, for det første, ved å måle uttrykksnivåene til spesifikke β-cellemarkører som MafA, NKX6.1, Pdx-1 og Ins1, samt dithizone farging for de genererte IPCene. For det andre ble vurderingen også utført funksjonelt av en glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS) analyse. Til slutt kan ad-MSCer enkelt isoleres, og viser alle MSC-karakteriseringskriterier, og de kan faktisk gi en rikelig, fornybar kilde til IPCer i laboratoriet for diabetesforskning.
Mesenchymale stamceller (MSCer), også kjent som mesenchymale stromale celler, er blant de mest brukte celletypene for regenerativ medisin 1,2. De er klassifisert som voksne stamceller og preget av multilineage differensieringspotensial og selvfornyelseskapasitet3. MSCer kan isoleres og hentes fra ulike kilder, inkludert fettvev, benmarg, perifert blod, navlestrengsvev og blod, hårsekkene og tennene 4,5.
Isolering av stamceller fra fettvev blir sett på som både tiltalende og lovende på grunn av deres enkle tilgang, rask ekspansjon in vitro og høyt utbytte6. Fettvevsavledede mesenchymale stamceller (Ad-MSC) kan isoleres fra forskjellige arter som mennesker, storfe, mus, rotter og, mer nylig, geiter7. Det har vist seg at Ad-MSCs nå er potensielle kandidater for vevsteknikk og gen/ celleterapi som til og med kan brukes til å utvikle et autologt alternativ for langsiktig reparasjon av bløtvevsskade eller defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har definert tre minimumskriterier som må stilles ut av MSC for full karakterisering9. Først må de være plasttilhørig. For det andre bør MSCer uttrykke mesenchymale stamcelleoverflateindikatorer som CD73, CD90 og CD105 og mangle uttrykk for de hematopoietiske markørene CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 og HLA-DR. Til slutt bør MSCer vise evne til å skille seg ut i de tre mesenchymale avstamningene: adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Interessant nok kan MSCer også skille seg ut i andre avledninger som nevronceller, kardiomyocytter, hepatocytter og epitelceller10,11.
Faktisk har MSC unike egenskaper som gjør dem i stand til å bli brukt som potensielle terapeutiske midler i regenerativ terapi for forskjellige sykdommer. MSCer kan utskille løselige faktorer for å indusere et immunmodulerende miljø som gir terapeutiske fordeler12. I tillegg kan MSC migrere mot steder med skade og tumormikromiljø for å levere målrettet terapi; Mekanismene er imidlertid ikke fullt ut belyst13. I tillegg har MSC evnen til å utskille eksosomer, ekstracellulære vesikler i nanoskalaen som bærer en last med ikke-kodende RNAer, protein og løselige faktorer, som i det siste dukket opp som en ny mekanisme for MSCs terapeutiske potensial i ulike sykdommer14.
Enda viktigere er at MSC-er har generert markert oppmerksomhet for deres potensial til å skille seg ut i insulinproduserende celler (IPCer), enten ved genetisk modifikasjon15,16 eller ved å bruke ulike ekstrinsisk-induserende faktorer innen kulturmediene in vitro17. IPC-induksjonsperioden varierer sterkt, da den avhenger av den brukte induksjonsprotokollen og de brukte ekstrinsiske faktorene. Differensieringsprosessen kan vare fra dager til måneder, og det krever en kombinasjon av eksogene induserende faktorer som må legges til og / eller trekkes tilbake i forskjellige stadier. Mange av disse faktorene som har blitt brukt til endokrine pankreas differensiering er biologisk aktive forbindelser som har vist seg å fremme spredning eller differensiering / neogenese av insulin-utskillende β-celler og / eller øke insulininnholdet i IPCer 18,19,20,21. Det er bemerkelsesverdig her at MSCs også har blitt rapportert å ha terapeutiske effekter i diabetes og dets komplikasjoner via flere mekanismer, inkludert deres sekretom, samt et bredt spekter av immunmodulerende handlinger 22,23,24.
I denne protokollen presenterer vi en detaljert trinnvis protokoll for isolering og karakterisering av ad-MSCer fra rotte epididymalt fett, etterfulgt av en enkel, relativt kort protokoll for generering av IPCer fra Ad-MSCer.
I denne protokollen klarte vi å presentere en detaljert protokoll for isolering av Ad-MSCer fra rotte epididymalt fett og differensiering av disse Ad-MSCene i IPCer. Faktisk er rotte epidydimalt fett en lett oppnåelig kilde til fettvev for å skaffe Ad-MSC og krever ikke noe spesialutstyr, verken for innsamling eller for behandling av 15,26,27. De isolerte ad-MSCene viste utmerket kulturutvidelse og viste alle kriteriene som s…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, veterinærspesialist, Farmasøytisk fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE) for å hjelpe til med disseksjonen av rottene.
Vi ønsker også å anerkjenne og sette pris på innsatsen fra Fakultet for massekommunikasjon, Det britiske universitetet i Egypt (BUE) for produksjon og redigering av videoen av dette manuskriptet.
Vi vil takke Miss Fatma Masoud, MSc, assisterende foreleser i engelsk, The British University in Egypt (BUE) for revisjon og engelskspråklig korrekturlesing av manuskriptet.
Dette arbeidet ble delvis finansiert av Center for Drug Research and Development (CDRD), Det farmasøytiske fakultet, Det britiske universitetet i Egypt (BUE), Kairo, Egypt.
Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |