Isolering av råtta fettvävnad mesenkymala stamceller för differentiering till insulinproducerande celler
Summary
Fettvävnads-härledda mesenkymala stamceller (Ad-MSC) kan vara en potentiell källa till MSC som differentieras till insulinproducerande celler (IPC). I detta protokoll tillhandahåller vi detaljerade steg för isolering och karakterisering av råtta epididymala Ad-MSC, följt av ett enkelt, kort protokoll för generering av IPC från samma råtta Ad-MSCs.
Abstract
Mesenkymala stamceller (MSC) – särskilt de som isoleras från fettvävnad (Ad-MSC) – har fått särskild uppmärksamhet som en förnybar, riklig källa till stamceller som inte utgör några etiska problem. Nuvarande metoder för att isolera Ad-MSC är dock inte standardiserade och använder komplicerade protokoll som kräver specialutrustning. Vi isolerade Ad-MSC från epididymalfettet hos Sprague-Dawley-råttor med en enkel, reproducerbar metod. De isolerade Ad-MSC: erna visas vanligtvis inom 3 dagar efter isolering, eftersom vidhäftande celler visar fibroblastisk morfologi. Dessa celler når 80% sammanflöde inom 1 vecka efter isolering. Därefter, vid passage 3-5 (P3-5), utfördes en fullständig karakterisering för de isolerade Ad-MSC: erna genom immunofenotypning för karakteristiska MSC-kluster av differentiering (CD) ytmarkörer såsom CD90, CD73 och CD105, samt inducera differentiering av dessa celler längs de osteogena, adipogena och kondrogena linjerna. Detta innebär i sin tur multipotensen hos de isolerade cellerna. Dessutom inducerade vi differentieringen av de isolerade Ad-MSC: erna mot de insulinproducerande cellerna (IPC) via ett enkelt, relativt kort protokoll genom att införliva Dulbeccos modifierade Eagle-medium (HG-DMEM) med hög glukos, β-merkaptoetanol, nikotinamid och exendin-4. IPC-differentiering bedömdes genetiskt, först genom att mäta uttrycksnivåerna för specifika β-cellmarkörer såsom MafA, NKX6.1, Pdx-1 och Ins1, samt ditizonfärgning för de genererade IPC: erna. För det andra utfördes bedömningen också funktionellt genom en glukosstimulerad insulinsekretionsanalys (GSIS). Sammanfattningsvis kan Ad-MSC: er enkelt isoleras och uppvisa alla MSC-karakteriseringskriterier, och de kan verkligen ge en riklig, förnybar källa till IPC i laboratoriet för diabetesforskning.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC), även kända som mesenkymala stromaceller, är bland de mest använda celltyperna för regenerativ medicin 1,2. De klassificeras som vuxna stamceller och kännetecknas av multilineage differentieringspotential och självförnyelsekapacitet3. MSC kan isoleras och erhållas från olika källor, inklusive fettvävnad, benmärg, perifert blod, navelsträngsvävnad och blod, hårsäckar och tänder 4,5.
Isoleringen av stamceller från fettvävnad ses som både tilltalande och lovande på grund av deras enkla åtkomst, snabba expansion in vitro och hög avkastning6. Fettvävnads-härledda mesenkymala stamceller (Ad-MSC) kan isoleras från olika arter som människor, nötkreatur, möss, råttor och, på senare tid, getter7. Det har bevisats att Ad-MSC nu är potentiella kandidater för vävnadsteknik och gen/cellterapi som till och med kan användas för att utveckla ett autologt alternativ för långsiktig reparation av mjukvävnadsskada eller defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har definierat tre minimikriterier som måste uppvisas av MSC för fullständig karakterisering9. Först måste de vara plastanhängande. För det andra bör MSC uttrycka mesenkymala stamcellsytemarkörer som CD73, CD90 och CD105 och sakna uttryck för de hematopoetiska markörerna CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 och HLA-DR. Slutligen bör MSC uppvisa förmågan att differentiera sig till de tre mesenkymala linjerna: adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Intressant nog kan MSC också differentieras till andra släktlinjer såsom neuronala celler, kardiomyocyter, hepatocyter och epitelceller10,11.
Faktum är att MSC har unika egenskaper som gör att de kan tillämpas som potentiella terapeutiska medel i regenerativ terapi för olika sjukdomar. MSC kan utsöndra lösliga faktorer för att inducera en immunmodulerande miljö som ger terapeutiska fördelar12. Dessutom kan MSC migrera mot skadeställen och tumörmikromiljöer för att leverera riktad terapi; mekanismerna är dock inte helt klarlagda13. Dessutom har MSC: er förmågan att utsöndra exosomer, extracellulära vesiklar i nanoskalan som bär en last av icke-kodande RNA, protein och lösliga faktorer, som nyligen framkom som en ny mekanism för MSC: s terapeutiska potential vid olika sjukdomar14.
Ännu viktigare är att MSC har genererat markant uppmärksamhet för deras potential att differentiera till insulinproducerande celler (IPC), antingen genom genetisk modifiering 15,16 eller genom att använda olika yttre inducerande faktorer inom odlingsmediet in vitro17. IPC-induktionsperioden varierar mycket, eftersom det beror på det använda induktionsprotokollet och de använda yttre faktorerna. Differentieringsprocessen kan pågå från dagar till månader, och det kräver en kombination av exogena inducerande faktorer som måste läggas till och / eller dras tillbaka i olika steg. Många av dessa faktorer som har använts för endokrin pankreasdifferentiering är biologiskt aktiva föreningar som har visat sig främja spridning eller differentiering / neogenes av insulinutsöndrande β-celler och / eller öka insulinhalten i IPC 18,19,20,21. Det är anmärkningsvärt här att MSC också har rapporterats ha terapeutiska effekter vid diabetes och dess komplikationer via flera mekanismer, inklusive deras sekretom, liksom ett brett spektrum av immunmodulerande åtgärder 22,23,24.
I detta protokoll presenterar vi ett detaljerat stegvis protokoll för isolering och karakterisering av Ad-MSC från råtta epididymalt fett, följt av ett enkelt, relativt kort protokoll för generering av IPC från Ad-MSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll lyckades vi presentera ett detaljerat protokoll för isolering av Ad-MSC från råtta epididymalt fett och differentieringen av dessa Ad-MSCs till IPC. Faktum är att epidydimalt fett från råtta är en lätt att uppnå källa till fettvävnad för att erhålla Ad-MSC och kräver ingen speciell utrustning, varken för insamling eller för bearbetning av 15,26,27. De isolerade Ad-MSC: erna visade utmärkt kultu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, veterinärspecialist, farmaceutiska fakulteten, British University of Egypt (BUE) för att ha hjälpt till med dissektion av råttorna.
Vi vill också erkänna och uppskatta ansträngningarna från fakulteten för masskommunikation, British University in Egypt (BUE) för produktion och redigering av videon av detta manuskript.
Vi vill tacka Fröken Fatma Masoud, MSc, biträdande lektor i engelska, British University in Egypt (BUE) för revisionen och engelskspråkig korrekturläsning av manuskriptet.
Detta arbete finansierades delvis av Center for Drug Research and Development (CDRD), Farmaceutiska fakulteten, British University in Egypt (BUE), Kairo, Egypten.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
Referências
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
