Fettvävnads-härledda mesenkymala stamceller (Ad-MSC) kan vara en potentiell källa till MSC som differentieras till insulinproducerande celler (IPC). I detta protokoll tillhandahåller vi detaljerade steg för isolering och karakterisering av råtta epididymala Ad-MSC, följt av ett enkelt, kort protokoll för generering av IPC från samma råtta Ad-MSCs.
Mesenkymala stamceller (MSC) – särskilt de som isoleras från fettvävnad (Ad-MSC) – har fått särskild uppmärksamhet som en förnybar, riklig källa till stamceller som inte utgör några etiska problem. Nuvarande metoder för att isolera Ad-MSC är dock inte standardiserade och använder komplicerade protokoll som kräver specialutrustning. Vi isolerade Ad-MSC från epididymalfettet hos Sprague-Dawley-råttor med en enkel, reproducerbar metod. De isolerade Ad-MSC: erna visas vanligtvis inom 3 dagar efter isolering, eftersom vidhäftande celler visar fibroblastisk morfologi. Dessa celler når 80% sammanflöde inom 1 vecka efter isolering. Därefter, vid passage 3-5 (P3-5), utfördes en fullständig karakterisering för de isolerade Ad-MSC: erna genom immunofenotypning för karakteristiska MSC-kluster av differentiering (CD) ytmarkörer såsom CD90, CD73 och CD105, samt inducera differentiering av dessa celler längs de osteogena, adipogena och kondrogena linjerna. Detta innebär i sin tur multipotensen hos de isolerade cellerna. Dessutom inducerade vi differentieringen av de isolerade Ad-MSC: erna mot de insulinproducerande cellerna (IPC) via ett enkelt, relativt kort protokoll genom att införliva Dulbeccos modifierade Eagle-medium (HG-DMEM) med hög glukos, β-merkaptoetanol, nikotinamid och exendin-4. IPC-differentiering bedömdes genetiskt, först genom att mäta uttrycksnivåerna för specifika β-cellmarkörer såsom MafA, NKX6.1, Pdx-1 och Ins1, samt ditizonfärgning för de genererade IPC: erna. För det andra utfördes bedömningen också funktionellt genom en glukosstimulerad insulinsekretionsanalys (GSIS). Sammanfattningsvis kan Ad-MSC: er enkelt isoleras och uppvisa alla MSC-karakteriseringskriterier, och de kan verkligen ge en riklig, förnybar källa till IPC i laboratoriet för diabetesforskning.
Mesenkymala stamceller (MSC), även kända som mesenkymala stromaceller, är bland de mest använda celltyperna för regenerativ medicin 1,2. De klassificeras som vuxna stamceller och kännetecknas av multilineage differentieringspotential och självförnyelsekapacitet3. MSC kan isoleras och erhållas från olika källor, inklusive fettvävnad, benmärg, perifert blod, navelsträngsvävnad och blod, hårsäckar och tänder 4,5.
Isoleringen av stamceller från fettvävnad ses som både tilltalande och lovande på grund av deras enkla åtkomst, snabba expansion in vitro och hög avkastning6. Fettvävnads-härledda mesenkymala stamceller (Ad-MSC) kan isoleras från olika arter som människor, nötkreatur, möss, råttor och, på senare tid, getter7. Det har bevisats att Ad-MSC nu är potentiella kandidater för vävnadsteknik och gen/cellterapi som till och med kan användas för att utveckla ett autologt alternativ för långsiktig reparation av mjukvävnadsskada eller defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har definierat tre minimikriterier som måste uppvisas av MSC för fullständig karakterisering9. Först måste de vara plastanhängande. För det andra bör MSC uttrycka mesenkymala stamcellsytemarkörer som CD73, CD90 och CD105 och sakna uttryck för de hematopoetiska markörerna CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 och HLA-DR. Slutligen bör MSC uppvisa förmågan att differentiera sig till de tre mesenkymala linjerna: adipocyter, osteocyter och kondrocyter. Intressant nog kan MSC också differentieras till andra släktlinjer såsom neuronala celler, kardiomyocyter, hepatocyter och epitelceller10,11.
Faktum är att MSC har unika egenskaper som gör att de kan tillämpas som potentiella terapeutiska medel i regenerativ terapi för olika sjukdomar. MSC kan utsöndra lösliga faktorer för att inducera en immunmodulerande miljö som ger terapeutiska fördelar12. Dessutom kan MSC migrera mot skadeställen och tumörmikromiljöer för att leverera riktad terapi; mekanismerna är dock inte helt klarlagda13. Dessutom har MSC: er förmågan att utsöndra exosomer, extracellulära vesiklar i nanoskalan som bär en last av icke-kodande RNA, protein och lösliga faktorer, som nyligen framkom som en ny mekanism för MSC: s terapeutiska potential vid olika sjukdomar14.
Ännu viktigare är att MSC har genererat markant uppmärksamhet för deras potential att differentiera till insulinproducerande celler (IPC), antingen genom genetisk modifiering 15,16 eller genom att använda olika yttre inducerande faktorer inom odlingsmediet in vitro17. IPC-induktionsperioden varierar mycket, eftersom det beror på det använda induktionsprotokollet och de använda yttre faktorerna. Differentieringsprocessen kan pågå från dagar till månader, och det kräver en kombination av exogena inducerande faktorer som måste läggas till och / eller dras tillbaka i olika steg. Många av dessa faktorer som har använts för endokrin pankreasdifferentiering är biologiskt aktiva föreningar som har visat sig främja spridning eller differentiering / neogenes av insulinutsöndrande β-celler och / eller öka insulinhalten i IPC 18,19,20,21. Det är anmärkningsvärt här att MSC också har rapporterats ha terapeutiska effekter vid diabetes och dess komplikationer via flera mekanismer, inklusive deras sekretom, liksom ett brett spektrum av immunmodulerande åtgärder 22,23,24.
I detta protokoll presenterar vi ett detaljerat stegvis protokoll för isolering och karakterisering av Ad-MSC från råtta epididymalt fett, följt av ett enkelt, relativt kort protokoll för generering av IPC från Ad-MSC.
I detta protokoll lyckades vi presentera ett detaljerat protokoll för isolering av Ad-MSC från råtta epididymalt fett och differentieringen av dessa Ad-MSCs till IPC. Faktum är att epidydimalt fett från råtta är en lätt att uppnå källa till fettvävnad för att erhålla Ad-MSC och kräver ingen speciell utrustning, varken för insamling eller för bearbetning av 15,26,27. De isolerade Ad-MSC: erna visade utmärkt kultu…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, veterinärspecialist, farmaceutiska fakulteten, British University of Egypt (BUE) för att ha hjälpt till med dissektion av råttorna.
Vi vill också erkänna och uppskatta ansträngningarna från fakulteten för masskommunikation, British University in Egypt (BUE) för produktion och redigering av videon av detta manuskript.
Vi vill tacka Fröken Fatma Masoud, MSc, biträdande lektor i engelska, British University in Egypt (BUE) för revisionen och engelskspråkig korrekturläsning av manuskriptet.
Detta arbete finansierades delvis av Center for Drug Research and Development (CDRD), Farmaceutiska fakulteten, British University in Egypt (BUE), Kairo, Egypten.
Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |