Avaliação locomotor de 6-Hidroxidopamina-induzido Modelo de Doença de Parkinson baseado em Zebrafish

Summary

O presente protocolo descreve a injeção intracerebroventricular (ICV) de zebrafish adulto com neurotóxifo 6-hidroxydopamina (6-OHDA) no diencephalon ventral (Dn) e a avaliação do prejuízo e posterior recuperação da pós-colisão do comportamento de natação usando o teste do tanque aberto, que é acompanhado pela análise usando um software de rastreamento de vídeo.

Abstract

As limitações dos tratamentos atuais para retardar a perda neuronal dopaminérgica na doença de Parkinson (DP) aumentam a necessidade de terapias alternativas que possam restaurar esses neurônios. Atualmente, muito esforço é direcionado para uma melhor compreensão da neuroregeneração usando modelos in vivo pré-clínicos. Esta capacidade regenerativa para auto-reparação é, no entanto, ineficiente em mamíferos. Animais não mamíferos como o zebrafish emergiram como um excelente modelo neuroregenerativo devido à sua capacidade de se auto-renovar continuamente e ter uma homologia cerebral próxima aos humanos. Como parte do esforço para elucidar eventos celulares envolvidos na neuroregeneração in vivo, estabelecemos o modelo de DP baseado em zebrafish adulto induzido por 6-OHDA (6-OHDA). Isso foi conseguido através da microinjeção intracerebroventricular otimizada (ICV) de 99,96 mM 6-OHDA para especificamente ablate neurônios dopaminérgicos (DpN) no diencephalon ventral (Dn) do cérebro de zebrafish. A imunofluorescência indicou mais de 85% da ablação da DPN no terceiro dia de pós-seção e restauração total da DPN no local lesionado 30 dias de pós-estação. O presente estudo determinou o comprometimento e posterior recuperação do comportamento de natação de zebrafish após a lesão, utilizando-se o teste de campo aberto através do qual foram quantificados dois parâmetros, distância percorrida (cm) e velocidade média (cm/s). A locomoção foi avaliada pela análise das gravações de peixes individuais de cada grupo (n = 6) utilizando software de rastreamento de vídeo. Os achados mostraram uma redução significativa (p < 0,0001) na velocidade (cm/s) e distância percorrida (cm) de zebrafish lesionado 3 dias após a pós-lesão quando comparado com sham. O zebrafish lesionado apresentou recuperação completa do comportamento de natação 30 dias após a pós-seção. Os presentes achados sugerem que o zebrafish adulto lesado 6-OHDA é um excelente modelo com qualidade reprodutível para facilitar o estudo da neuroregeneração em PD. Estudos futuros sobre os mecanismos subjacentes à neuroregeneração, bem como fatores intrínsecos e extrínsecos que modulam o processo podem fornecer informações importantes sobre novas estratégias de tratamento de substituição celular contra a DP.

Introduction

A doença de Parkinson (DP), doença caracterizada pela rigidez muscular, tremor de repouso e bradiquinia, é a doença neurológica que mais cresce no ^mundo1,2. O risco e a prevalência da DP aumentam rapidamente com a idade, especialmente em indivíduos com 50 anos ou mais ^{de 3 anos}. A etiologia e a patogênese da DP até agora permanecem mal compreendidas. Isso muitas vezes deixou o início precoce do PD sem diagnóstico. Atualmente, a falta de dopamina e a perda de neurônios dopaminérgicos (DP) em pacientes com DP estão fortemente ligados à manifestação dos sintomas ^motores4. Capitalizando essa relação, vários tratamentos foram projetados para atuar diretamente como substituição de dopamina (ou seja, levodopa) ou para compensar a perda de DPN (ou seja, estimulação cerebral profunda). Embora esses tratamentos tragam benefícios sintomáticos, eles não modificam o curso deteriorado da ^doença5. Diante dessa fraqueza significativa, a terapia de reposição celular foi proposta. A eficácia dessa abordagem é, no entanto, inconsistente, dado os desafios da preparação do enxerto, controle do crescimento celular e instabilidade do fenótipo. A terapia de reposição celular, que havia levantado preocupações éticas, também representa o risco de induzir tumores cerebrais e reações imunológicas ^{indesejadas6,7}.

As limitações das estratégias terapêuticas atuais têm levado a uma maior ênfase na regeneração da DPN como abordagem potencial no tratamento da DP. A regeneração da DPN ou neuroregeneração tem emergido como um dos avanços promissores no manejo da DPP, não apenas devido ao seu potencial como novo método terapêutico, mas também como meios de compreender o mecanismo da ^{doença8, 9}. Esta abordagem se concentra na restauração da função neuronal através da diferenciação, migração e integração das células progenitoras existentes nos circuitos ^lesados10. Para explorar ainda mais a neuroregeneração, vários estudos in vivo foram realizados. Verificou-se que vertebrados como mamíferos, anfíbios e répteis geram novas células cerebrais após ^lesões11,12. Entre os vertebrados, os animais mamíferos são mais procurados dada a sua semelhança genética com os seres humanos. Os mamíferos, no entanto, apresentam uma capacidade reparativa limitada e precária no sistema nervoso central (SNC) que pode durar até a idade adulta após uma lesão ^cerebral13. Em geral, os mamíferos não são adequados como modelos animais para entender a neuroregeneração, dado que o baixo número de neurônios produzidos não será suficiente para restaurar circuitos neurais danificados observados em DP. Como tal, o modelo baseado em teleemst, especificamente em zebrafish, é muito favorecido por sua alta taxa de proliferação, capacidade de se auto-renovar continuamente e fechar a homologia cerebral com ^humanos14,15.

O zebrafish é mais comumente usado para estudar o movimento desordenado em ^PD16. O modelo PD à base de zebrafish é geralmente induzido por neurotoxinas, que incluem 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP) e 6-hidroxidopamina (6-OHDA)¹⁷. Embora eficaz em induzir perda específica de DPN e diminuição dos níveis de dopamina, os modelos baseados em MPTP não imitam de perto as condições da DP, uma vez que a perda de DPN não se restringe apenas ao ^CNS18. A incapacidade do 6-OHDA de atravessar a barreira hemencefálica restringiu seus efeitos em alterações celulares e funcionais dentro do cérebro quando é administrado intracranianamente em oposição a ^{intramuscularmente19}. A administração periférica do 6-OHDA causou uma redução global dos níveis de dopamina em todo o sistema ^nervoso20. Enquanto a administração do 6-OHDA no fluido cefalorraquidiano causou ablação da DPN em todo o ^CNS21, que não imita a condição vista em DP, pelo qual a perda de DPN ocorre especificamente na substantia nigra do cérebro humano. A administração do ICV de 6-OHDA, pelo contrário, induziu especificamente ablação significativa da DPN na área de Dn ventral no cérebro de zebrafish, que se assemelhava muito à substantia ^nigra22. Curiosamente, a recuperação da DPN foi relatada 30 dias após lesão induzida por 6 OHDA e esses neurônios sobreviveram ao longo da ^vida23,24. A recuperação funcional da DPN foi demonstrada por meio de uma avaliação locomotora de distância percorrida (cm) e velocidade média (cm/s) utilizando o modelo PD adulto induzido por zebrafish 6-OHDA^{, modelo22}.

Protocol

O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Pesquisa e Ética Animal (CARE), Universidade Technologi MARA (UiTM) [Referência nº: UiTM CARE 346/2021, com data de 7 de maio de 2021]. NOTA: Foram utilizados os protocolos publicados22,25,26 para a criação padrão e a manutenção do modelo de PD de zebrafish adulto de 6-OHDA. Foram realizados experimentos com zebrafish macho adulto (Danio rer…

Representative Results

O presente experimento avaliou as mudanças no comportamento adulto de natação de zebrafish após a microinjeção do ICV com 6-OHDA. A razão para o uso do 6-OHDA como a neurotoxina escolhida foi devido à sua incapacidade de atravessar a barreira hematoencefálica, que produziu ablação específica e direcionada de DPN na área de diencephalon de interesse-ventral (Dn)16. A subpopulação do DPN aqui tem semelhança anatômica com a subpopulação dpn na substantia nigra pars <sup class="xref…

Discussion

O presente trabalho demonstrou com sucesso a avaliação locomotor do modelo de DP baseado em zebrafish adulto induzido por 6 OHDA. Todo o experimento envolveu três passos principais: preparações de microinjeção pré-ICV, microinjeção de ICV de zebrafish e avaliação locomotor. Para garantir a recuperação saudável dos zebrafish adultos após o procedimento de microinjeção do ICV e o bom resultado experimental, algumas boas práticas para cada etapa foram recomendadas no presente estudo.

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Materials

Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
Ascorbic acid	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
Nice conical flask, 100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	106404
Stereomicroscope	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
Equipment
ANY-maze software	Stoelting Co., Illinois, USA	–	version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV microinjector	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED Portable Lamp	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda aquarium heater	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
Thermometer	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
Video camera	Nikon, Tokyo, Japan	D3100