JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

6-Hidroksidopamin Kaynaklı Yetişkin Zebra Balığı Bazlı Parkinson Hastalığı Modelinin Lokomotor Değerlendirmesi

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63355
, , , , , ,
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy,Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine,Universiti Malaya

Summary

Bu protokol, yetişkin zebra balıklarının ventral diensefalonda (Dn) nörotoksik 6-hidroksidopamin (6-OHDA) ile intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonunu ve bir video izleme yazılımı kullanılarak analizin eşlik ettiği açık tank testi kullanılarak yüzme davranışı postlezyonunun bozulmasının ve daha sonra iyileşmesinin değerlendirilmesini açıklamaktadır.

Abstract

Parkinson hastalığında (PD) dopaminerjik nöronal kaybı geciktirmede mevcut tedavilerin sınırlamaları, bu nöronları geri yükleyebilecek alternatif tedavilere olan ihtiyacı artırmaktadır. Şu anda preklinik in vivo modeller kullanılarak nörorejenerasyonun daha iyi anlaşılması için çok çaba sarf edilmektedir. Bununla birlikte, kendi kendini onarmak için bu rejeneratif yetenek, memelilerde verimsizdir. Zebra balığı gibi memeli olmayan hayvanlar, sürekli kendini yenileme ve insanlara yakın bir beyin homolojisine sahip olma kabiliyeti nedeniyle mükemmel bir nörorejeneratif model olarak ortaya çıkmıştır. İn vivo nörorejenerasyonda yer alan hücresel olayları aydınlatma çabalarının bir parçası olarak, 6-hidroksidopamin (6-OHDA) kaynaklı yetişkin zebra balığı bazlı PD modelini kurduk. Bu, zebra balığı beyninin ventral diensefalonunda (Dn) dopaminerjik nöronları (DpN) spesifik olarak ablate etmek için 99.96 mM 6-OHDA’nın optimize edilmiş intraserebroventriküler (ICV) mikroenjeksiyonu ile elde edildi. İmmünofloresan, postlezyonun üçüncü gününde DpN ablasyonunun %85’inden fazlasını ve lezyonlu bölgede 30 günlük postlezyonda DpN’nin tam restorasyonunu gösterdi. Bu çalışma, lezyonu takiben zebra balığı yüzme davranışının bozulmasını ve ardından iyileşmesini, kat edilen mesafe (cm) ve ortalama hız (cm / s) olmak üzere iki parametrenin ölçüldüğü açık alan testi kullanılarak belirlemiştir. Hareket, video izleme yazılımı kullanılarak her grubun (n = 6) ayrı balıklarının kayıtlarını analiz ederek değerlendirildi. Bulgular, lezyonlu zebra balıklarının 3 gün postlezyonunda (p) shamile kıyasla hızlarında (cm / s) ve kat edilen mesafede (cm) anlamlı bir azalma (p < 0.0001) gösterdi. Lezyonlu zebra balığı, 30 gün sonra yüzme davranışının tamamen iyileştiğini gösterdi. Mevcut bulgular, 6-OHDA lezyonlu yetişkin zebra balığının, PD'de nörorejenerasyonun incelenmesini kolaylaştırmak için tekrarlanabilir kalitede mükemmel bir model olduğunu göstermektedir. nörorejenerasyonun altında yatan mekanizmaların yanı sıra süreci modüle eden içsel ve dışsal faktörler üzerine gelecekteki çalışmalar, PD'ye karşı yeni hücre replasman tedavi stratejileri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Introduction

Parkinson hastalığı (PD), kas sertliği, istirahat titremesi ve bradikinezi ile belirgin bir şekilde karakterize bir hastalık, dünyada en hızlı büyüyen nörolojik hastalıktır1,2. Özellikle 50 yaş ve üzeri bireylerde PD riski ve prevalansı yaşla birlikte hızla artmaktadır3. PH’nin etiyolojisi ve patogenezi bugüne kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu genellikle PD’nin erken başlangıcını tanı konmamış bırakmıştır. Şu anda, PD hastalarında dopamin eksikliği ve dopaminerjik nöronların (DpN) kaybı, motor semptomların tezahürü ile güçlü bir şekilde bağlantılıdır4. Bu ilişkiden yararlanarak, doğrudan dopamin replasmanı (yani levodopa) olarak hareket etmek veya DpN kaybını (yani derin beyin stimülasyonu) telafi etmek için çeşitli tedaviler tasarlanmıştır. Bu tedaviler semptomatik faydalar sağlasa da, hastalığın kötüleşen seyrini değiştirmez5. Bu önemli zayıflık göz önüne alındığında, hücre replasman tedavisi önerilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği, greft hazırlama, hücre büyüme kontrolü ve fenotip instabilitesinin zorlukları göz önüne alındığında tutarsızdır. Etik kaygıları artıran hücre replasman tedavisi, beyin tümörlerini ve istenmeyen bağışıklık reaksiyonlarını tetikleme riskini de beraberinde getirmektedir6,7.

Mevcut terapötik stratejilerin sınırlılıkları, PD tedavisinde potansiyel bir yaklaşım olarak DpN’nin rejenerasyonuna daha fazla vurgu yapılmasına yol açmıştır. DpN veya nörorejenerasyonun rejenerasyonu, sadece yeni bir terapötik yöntem olarak potansiyeli nedeniyle değil, aynı zamanda hastalığın mekanizmasını anlama aracı olarak da PD’nin yönetiminde umut verici atılımlardan biri olarak ortaya çıkmıştır8, 9. Bu yaklaşım, farklılaşma, migrasyon ve mevcut progenitör hücrelerin lezyonlu devreye entegrasyonu yoluyla nöronal fonksiyonun restorasyonuna odaklanmaktadır10. Nörorejenerasyonu daha fazla araştırmak için, çeşitli in vivo çalışmalar yapılmıştır. Memeliler, amfibiler ve sürüngenler gibi omurgalıların yaralanma sonrası yeni beyin hücreleri ürettikleri bulunmuştur11,12. Omurgalılar arasında, memeli hayvanlar, insanlara genetik benzerlikleri nedeniyle daha çok aranmaktadır. Bununla birlikte, memeliler, merkezi sinir sisteminde (CNS) bir beyin lezyonunu takiben yetişkinliğe kadar sürebilen sınırlı ve zayıf onarıcı kapasite sergilerler13. Genel olarak, memeliler, üretilen düşük sayıda nöronun PD’de gözlenen hasarlı sinir devrelerini restore etmek için yeterli olmayacağı göz önüne alındığında, nörorejenerasyonu anlamak için hayvan modelleri olarak uygun değildir. Bu nedenle, özellikle zebra balıklarında teleost tabanlı model, yüksek proliferatif oranı, sürekli kendini yenileme kabiliyeti ve insanlarla beyin homolojisini kapatma kabiliyeti nedeniyle büyük ölçüde tercih edilmektedir14,15.

Zebra balığı en yaygın olarak PD16’daki düzensiz hareketi incelemek için kullanılır. Zebra balığı bazlı PD modeli genellikle 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ve 6-hidroksidopamin (6-OHDA)17 içeren nörotoksinler tarafından indüklenir. Spesifik DpN kaybını ve dopamin seviyelerinin azalmasını indüklemede etkili olmasına rağmen, MPTP tabanlı modeller, DpN kaybı yalnızca CNS18 ile sınırlı olmadığından PD koşullarını yakından taklit etmez. 6-OHDA’nın kan-beyin bariyerini geçememesi, intramüsküler olarak değil, intrakraniyal olarak uygulandığında beyindeki hücresel ve fonksiyonel değişiklikler üzerindeki etkilerini kısıtlamıştır19. 6-OHDA’nın periferik uygulaması, sinir sistemi boyunca dopamin seviyelerinin küresel olarak azalmasına neden olmuştur20. 6-OHDA’nın beyin omurilik sıvısına uygulanması, CNS21 boyunca DpN’nin ablasyonuna neden olurken, PD’de görüldüğü gibi durumu taklit etmez, bu sayede DpN kaybı özellikle insan beyninin substantia nigra’sında meydana gelir. 6-OHDA’nın ICV uygulaması, aksine, zebra balığı beynindeki ventral Dn bölgesinde, substantia nigra22’ye çok benzeyen DpN’nin önemli ablasyonunu spesifik olarak indükledi. İlginçtir ki, DpN’nin iyileşmesi 6-OHDA kaynaklı lezyondan 30 gün sonra bildirilmiştir ve bu nöronlar yaşam boyunca hayatta kalmıştır23,24. DpN’nin fonksiyonel geri kazanımı, 6-OHDA kaynaklı yetişkin zebra balığı bazlı PD modeli 22 kullanılarak kat edilen mesafenin (cm) ve ortalama hızın (cm/s) lokomotor değerlendirmesi ile gösterilmiştir.

Protocol

Bu çalışma, Hayvan Araştırma ve Etiği Komitesi (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referans No: UiTM CARE 346/2021, 7 Mayıs 2021 tarihli] tarafından onaylanmıştır. NOT: Standart hayvancılık ve 6-OHDA lezyonlu yetişkin zebra balığı PD modelinin bakımı için yayınlanmış protokoller22,25,26 kullanılmıştır. Deneyler, standart uzunluğu 3.2-3.7 cm olan beş aylıktan daha e…

Representative Results

Bu deney, 6-OHDA ile ICV mikroenjeksiyonunu takiben yetişkin zebra balığı yüzme davranışındaki değişiklikleri değerlendirdi. 6-OHDA’nın tercih edilen nörotoksin olarak kullanılmasının nedeni, ilgilenilen ventral diensefalon (Dn) 16 alanında DpN’nin spesifik ve hedefli ablasyonunu üreten kan-beyin bariyerini geçememesinden kaynaklanıyordu. Buradaki DpN alt popülasyonu, insanın substantia nigra pars compacta31’indeki DpN alt popülasyonuna anatomik benze…

Discussion

Bu çalışma, kurulan 6-OHDA kaynaklı, yetişkin zebra balığı bazlı PD modelinin lokomotor değerlendirmesini başarıyla göstermiştir. Tüm deney üç ana adımdan oluşuyordu: ICV öncesi mikroenjeksiyon preparatları, zebra balıklarının ICV mikroenjeksiyonu ve lokomotor değerlendirme. ICV mikroenjeksiyon prosedürünü takiben yetişkin zebra balıklarının sağlıklı bir şekilde iyileşmesini ve iyi deneysel sonuçları sağlamak için, bu çalışmada her adım için bazı iyi uygulamalar önerilmişt…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Malezya Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından Temel Araştırma Hibe Programı [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)] kapsamında desteklenmiştir.

Materials

Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA – version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson’s Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
  3. Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson’s Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
  4. Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
  5. Cookson, M. R. . Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , 157-174 (2017).
  6. Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
  7. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
  8. Foltynie, T. Can Parkinson’s disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
  9. Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
  10. Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
  11. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  12. Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
  13. La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
  14. Ferretti, P., Prasongchean, W. . Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , 1-21 (2015).
  15. Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson’s Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
  16. Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson’s disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
  17. Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
  18. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  19. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
  20. Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
  21. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  22. Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson’s disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
  23. Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
  24. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
  25. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
  26. Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
  27. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  28. Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
  29. Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
  30. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  31. Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson’s disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
  32. Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
  33. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  34. Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
  35. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  36. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
  37. Barbosa Júnior, A., et al. . Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, 323-330 (2012).
  38. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
  39. Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
  40. Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
  41. Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
  42. Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
  43. Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
  44. Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
  45. Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
  46. Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
  47. Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
  48. Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
  49. Burghardt, G. M., et al. Perspectives – Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
  50. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  51. Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
  52. Beal, M. F. Parkinson’s disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
  53. Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
  54. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).

Tags

ZebrafishParkinson’s Disease6-hydroxydopamineLocomotor AssessmentMotor ImpairmentDopaminergic NeuronsIntracerebroventricular InjectionNeuroregenerationCell ReplacementTricaine MethanesulfonateAnesthesiaMicrocapillary Injector
check_url/pt/63355?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson’s Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image