Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris
Summary
Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.
Abstract
Les microtubules, composés de dimères de α/β-tubuline, sont un composant crucial du cytosquelette des cellules eucaryotes. Ces polymères tubulaires présentent une instabilité dynamique lorsque les sous-unités hétérodimères de tubuline subissent une polymérisation et une dépolymérisation répétitives. Un contrôle précis de la stabilité et de la dynamique des microtubules, obtenu grâce à des modifications post-traductionnelles de la tubuline et à des protéines associées aux microtubules, est essentiel pour diverses fonctions cellulaires. Les dysfonctionnements des microtubules sont fortement impliqués dans la pathogenèse, y compris les troubles neurodégénératifs. Les recherches en cours se concentrent sur les agents thérapeutiques ciblant les microtubules qui modulent la stabilité, offrant des options de traitement potentielles pour ces maladies et cancers. Par conséquent, la compréhension de l’état dynamique des microtubules est cruciale pour évaluer la progression de la maladie et les effets thérapeutiques.
Traditionnellement, la dynamique des microtubules a été évaluée in vitro ou dans des cellules en culture par fractionnement approximatif ou immunoessai, à l’aide d’anticorps ciblant les modifications post-traductionnelles de la tubuline. Cependant, l’analyse précise du statut de la tubuline dans les tissus à l’aide de telles procédures pose des défis. Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple et innovante de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris.
La procédure a consisté à homogénéiser des tissus de souris disséqués dans un tampon stabilisateur de microtubules à un rapport de volume de 19 :1. Les homogénats ont ensuite été fractionnés par un processus d’ultracentrifugation en deux étapes après une centrifugation lente initiale (2 400 × g) pour éliminer les débris. La première étape d’ultracentrifugation (100 000 × g) a précipité les microtubules stables, tandis que le surnageant résultant a été soumis à une deuxième étape d’ultracentrifugation (500 000 × g) pour fractionner les microtubules labiles et les dimères de tubuline solubles. Cette méthode a permis de déterminer les proportions de tubuline constituant des microtubules stables ou labiles dans le cerveau de la souris. De plus, des variations tissulaires distinctes dans la stabilité des microtubules ont été observées qui étaient corrélées avec la capacité proliférative des cellules constitutives. Ces résultats mettent en évidence le potentiel important de cette nouvelle méthode pour l’analyse de la stabilité des microtubules dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Introduction
Les microtubules (MT) sont des structures tubulaires allongées comprenant des protofilaments constitués de sous-unités hétérodimères α/β-tubuline. Ils jouent un rôle essentiel dans divers processus cellulaires tels que la division cellulaire, la motilité, le maintien de la forme et le transport intracellulaire, ce qui en fait des composants intégraux du cytosquelette eucaryote1. L’extrémité négative des MT, où la sous-unité α-tubuline est exposée, est relativement stable, tandis que l’extrémité positive, où la sous-unité β-tubuline est exposée, subit une dépolymérisation dynamique et une polymérisation2. Ce cycle continu d’ajout et de dissociation des dimères de tubuline à l’extrémité positive, appelé instabilité dynamique, entraîne un processus répétitif de sauvetage et de catastrophe3. Les MT présentent des domaines focaux avec des variations localisées de l’instabilité dynamique, y compris des domaines stables et labiles4.
Un contrôle précis de l’instabilité dynamique des MT est crucial pour de nombreuses fonctions cellulaires, en particulier dans les neurones caractérisés par des morphologies complexes. L’adaptabilité et la durabilité des MT jouent un rôle essentiel dans le développement et le bon fonctionnement des cellules nerveuses 5,6,7. L’instabilité dynamique des MT s’est avérée être associée à diverses modifications post-traductionnelles (PTM) de la tubuline, telles que l’acétylation, la phosphorylation, la palmitoylation, la détyrosination, le delta 2, l’oxydation de la polyglutamine et la polyglycylation. De plus, la liaison des protéines associées aux microtubules (MAP) sert de mécanisme de régulation8. Les PTM, à l’exclusion de l’acétylation, se produisent principalement dans la région carboxy-terminale de la tubuline située sur la surface externe des MT. Ces modifications créent des conditions de surface diverses sur les MT, influençant leur interaction avec les MAP et, en fin de compte, régissant la stabilité des MT9. La présence d’un résidu de tyrosine carboxy-terminale dans la α-tubuline est révélatrice de MT dynamiques, qui sont rapidement remplacées par le pool de tubuline libre. À l’inverse, la détyrosination de l’extrémité carboxy et l’acétylation de Lys40 signifient des MT stables avec une instabilité dynamique réduite 9,10.
Les PTM de la tubuline ont été largement utilisés dans des expériences visant à évaluer la dynamique et la stabilité des MT 5,7,11,12,13,14,15. Par exemple, dans les études de culture cellulaire, les tubulines peuvent être séparées en deux pools : le pool de tubulines libres et le pool MT. Ceci est réalisé en libérant de la tubuline libre par perméabilisation cellulaire avant de fixer les MT restantes 15,16,17,18,19. Les méthodes biochimiques impliquent l’utilisation de stabilisateurs chimiques de MT qui protègent les MT d’une catastrophe, permettant la séparation des MT et de la tubuline libre par centrifugation20,21,22. Cependant, ces procédures ne font pas la différence entre les MT stables et moins stables (labiles), ce qui rend impossible la quantification des MT ou de la tubuline soluble dans des tissus comme le cerveau. Par conséquent, l’évaluation de la stabilité de la TA chez les organismes dans des conditions physiologiques et pathologiques s’est avérée difficile. Pour remédier à cette limite expérimentale, nous avons mis au point une nouvelle technique permettant de séparer avec précision les MT et la tubuline libre dans les tissus de souris23.
Cette méthode unique de fractionnement de la magnétoscopie implique l’homogénéisation des tissus dans des conditions qui maintiennent le statut de la tubuline dans les tissus et la centrifugation en deux étapes pour séparer les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre. Cette procédure simple peut être appliquée à de vastes études, y compris la recherche fondamentale sur les MT et les MAP dans les organismes vivants, les analyses physiologiques et pathologiques de la santé et des maladies associées à la stabilité des MT, et le développement de médicaments et d’autres thérapies qui ciblent les MT.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tâche la plus importante lors de l’étude de l’état de la tubuline dans les tissus d’organismes vivants est d’empêcher la polymérisation ou la dépolymérisation accidentelle de la magnétoscopie pendant la préparation. La stabilité des MT dans les échantillons est affectée par des facteurs tels que la concentration de Taxol dans la MSB, la proportion de quantité tissulaire à tamponner et la température pendant le processus allant du prélèvement des tissus à l’homogénéisation et à la centrif…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par JST, la création de bourses universitaires pour la création d’innovations scientifiques et technologiques (A.HT. ; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT. ; JPMJSP2129), une subvention d’aide pour les boursiers de la JSPS (A.HT ; 23KJ2078), une subvention d’aide à la recherche scientifique (B) JSPS KAKENHI (22H02946 pour la MT), une subvention d’aide à la recherche scientifique dans des domaines innovants intitulée « Brain Protein Aging and Dementia Control » de MEXT (TM ; 26117004), et une bourse de recherche Uehara de la Fondation commémorative d’Uehara (TM ; 202020027). Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.
Materials
| 1.5 ML TUBE CASE OF 500 | Beckman Coulter | 357448 | |
| 1A2 | Sigma-Aldrich | T9028 | 1:5,000 dilution |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Nacalai Tesque | 02442-44 | |
| 300 kDa ultrafiltration spin column | Aproscience | PT-1013 | |
| 6-11B1 | Sigma-Aldrich | T7451 | 1:5,000 dilution |
| AKTA prime plus | Cytiva | ||
| anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 dilution |
| antipain | Peptide Institute Inc. | 4062 | |
| aprotinin | Nacalai Tesque | 03346-84 | |
| Chemi-Lumi One L | Nacalai Tesque | 07880-54 | |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Corning | 430758 | 0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane |
| DIFP | Sigma-Aldrich | 55-91-4 | |
| DIGITAL HOMOGENIZER | AS ONE | HOM | |
| DM1A | Sigma-Aldrich | T9026 | 1:5,000 dilution |
| DTT | Nacalai Tesque | 14128-46 | |
| EGTA | Nacalai Tesque | 37346-05 | |
| FluoroTrans W 3.3 Meter Roll | Pall Corporation | BSP0161 | |
| glycerol | Nacalai Tesque | 17018-25 | |
| GTP | Nacalai Tesque | 17450-61 | |
| HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman | TOMY | ||
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column | Cytiva | 28-9893-35 | |
| Image Gauge Software | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| ImmunoStar LD | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | 292-69903 | |
| KMX-1 | Millipore | MAB3408 | 1:5,000 dilution |
| LAS-4000 luminescent image analyzer | FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| leupeptin | Peptide Institute Inc. | 43449-62 | |
| MgSO4 | Nacalai Tesque | 21003-75 | |
| Na3VO4 | Nacalai Tesque | 32013-92 | |
| NaF | Nacalai Tesque | 31420-82 | |
| okadaic acid | LC Laboratories | O-2220 | |
| OPTIMA MAX-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| pepstatin | Nacalai Tesque | 26436-52 | |
| PMSF | Nacalai Tesque | 27327-81 | |
| Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2 | Beckman Coulter | 343778 | |
| Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 5056489001 | |
| Purified tubulin | Cytoskeleton | T240 | |
| QSONICA Q55 | QSonica | Q55 | |
| Taxol | LC Laboratories | P-9600 | |
| TLA-120.2 rotor | Beckman Coulter | 357656 | |
| TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 366725 | |
| TLCK | Nacalai Tesque | 34219-94 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
Referências
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