记录来自 非洲爪蟾 卵母细胞的间隙结电流
Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于表达 非洲爪蟾 卵母细胞中的间隙连接蛋白，并使用商业放大器记录两个附着的卵母细胞之间的连接电流，该放大器设计用于在高压侧电流测量模式下记录双卵母细胞电压钳位记录。
Abstract
非洲爪蟾卵母细胞中连接蛋白和连接蛋白的异源表达是研究间隙连接（GJs）生物物理性质的有力方法。然而，这种方法在技术上具有挑战性，因为它需要两个对立的卵母细胞共享一个共同点的差分电压钳位。虽然少数实验室已经成功地执行了这种技术，但基本上他们都使用了自制放大器或专为单卵母细胞记录而设计的商业放大器。对于其他实验室来说，实施这种技术通常具有挑战性。尽管高边电流测量模式已被整合到用于双卵母细胞电压钳位记录的商用放大器中，但在我们最近的研究之前，还没有关于其应用的报告。我们通过引入一些技术修改，使高端电流测量方法更加实用和方便，包括构建基于磁性的记录平台，允许精确放置卵母细胞和各种电极，使用浴溶液作为电压差分电极中的导体，采用商用低泄漏KCl电极作为参比电极， 从薄壁玻璃毛细管制造电流和电压电极，并使用磁性器件定位所有电极。这里描述的方法允许方便和可靠地记录两个对立的非洲爪蟾卵母细胞之间的结电流（Ij）。
Introduction
GJ是细胞间通道，可能允许相邻细胞之间小细胞质分子的电流流动和交换。它们存在于许多细胞类型中，并执行不同的生理功能。脊椎动物中的GJ由连接蛋白形成，而无脊椎动物中的GJ由连接蛋白形成。每个GJ由两个并列的半透明细胞组成，每个半汉奈尔有6个或8个亚基，这取决于它们是连接蛋白还是连接蛋白1，2，3。人类有21个连接蛋白基因4个，而常用的无脊椎动物模型 秀丽隐杆线虫 和 黑腹果蝇 有25个和8个连接蛋白基因，分别为5，6个。基因转录本的替代剪接可能进一步增加GJ蛋白的多样性，至少对于连接蛋白7，8。
GJs可以根据分子组成分为三类：同型，异型和异构。同型GJ的所有亚基都是相同的。异型GJ具有两个同构半透明质，但两个半质由两种不同的GJ蛋白形成。异构体GJ含有至少一种异构半构体。GJ的分子多样性可能赋予对其生理功能很重要的独特生物物理特性。GJ生物物理性质也由调节蛋白9调节。要了解GJ如何执行其生理功能，重要的是要了解它们的分子组成，生物物理性质以及调节蛋白在其功能中的作用。
异源表达系统通常用于研究离子通道（包括GJ）的生物物理性质以及调节蛋白对它们的影响。由于异源表达系统允许特定蛋白质的表达，因此它们通常比天然组织更适合解剖蛋白质功能，其中具有冗余功能的蛋白质会使分析复杂化，并且可能无法实现Ij的记录。不幸的是，除了Neuro-2A细胞外，最常用的细胞系由于内源性连接蛋白的并发症而不适合研究GJ的生物物理特性。即使是Neuro-2A细胞也并不总是适合这种分析。例如，在不存在或存在UNC-1（未发表）的情况下，我们无法在转染有连接蛋白UNC-7和UNC-9的Neuro-2A细胞中检测到任何Ij，这是秀丽隐杆线虫9，10中UNC-9 GJs功能所必需的。另一方面，非洲爪蟾卵母细胞是GJs电生理学分析的有用替代系统。尽管它们表达内源性GJ蛋白Connexin 38（Cx38）11，但通过注射特定的反义寡核苷酸12可以很容易地避免潜在的并发症。然而，使用非洲爪蟾卵母细胞分析GJ需要两个并置细胞的差分电压钳位，这在技术上具有挑战性。青蛙爆破粒双电压钳的最早成功是在大约40年前的13，14。从那时起，许多研究使用这种技术来记录配对非洲爪蟾卵母细胞中的Ij。然而，基本上所有以前的研究都是使用自制放大器12，15，16或设计用于单个卵母细胞记录的商业放大器（GeneClamp 500，AxoClamp 2A或AxoClamp 2B，Axon Instruments，Union City，CA）8，17，18，19，20.由于即使是商用放大器也不提供双卵母细胞电压钳位的指令，因此对于新的或不太复杂的电生理学实验室来说，实施这种技术通常具有挑战性。
只有一种商用放大器是为双卵母细胞电压钳位开发的，即华纳仪器的OC-725C（材料表，图1A）。该放大器可以以标准模式（对于单个卵母细胞）或高侧电流测量模式（对于单或双卵母细胞）使用，具体取决于其电压探头中的两个插座是否连接（图1B，C）。然而，直到我们最近的研究7，还没有一份出版物描述该放大器在其高端电流测量模式下的使用。尽管该放大器已被另一个实验室用于双卵母细胞记录，但它用于标准而不是高边模式21，22。在高端电流测量模式下使用放大器缺乏报告可能是由于技术困难造成的。我们无法按照制造商的说明使用高边模式获得稳定的双卵母细胞记录。多年来，我们尝试了三种不同的双卵母细胞记录方法，包括在高压侧电流测量模式下使用两个OC-725C放大器，在标准模式下使用两个OC-725C放大器，以及两个来自其他制造商的放大器。经过广泛的反复试验，我们最终仅通过第一种方法成功获得了稳定的录音。本出版物描述并演示了我们用于表达非洲爪蟾卵母细胞中GJ蛋白的程序，使用高边电流测量模式记录Ij，并使用流行的商业软件分析电生理数据。关于双电压钳位技术的其他信息可以在其他出版物19，23中找到。
Protocol
Representative Results
Discussion
系统优化似乎是双卵母细胞电压钳夹实验所必需的。没有它，录音可能非常不稳定，放大器可能不得不注入过多的电流才能到达目标 Vm，从而导致卵母细胞损伤和记录失败。有几个因素对于使用高压侧电流测量方法获得稳定的双卵母细胞记录至关重要。首先，电流和电压电极必须具有适当的电阻（~1 MΩ），并且其支架必须清洁。其次， VDIFF 电极必须具有低电阻（<150 kΩ）并?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢詹海英，钱戈参与技术开发的初始阶段，Kiranmayi Vedantham帮助处理数字，以及Camillo Peracchia博士对卵母细胞配对室的建议。
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologia do Desenvolvimento. 156 (2), 490-499 (1993).
