Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten
Summary
Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.
Abstract
Heterologe expressie van connexinen en innexinen in Xenopus-eicellen is een krachtige benadering voor het bestuderen van de biofysische eigenschappen van gap junctions (GI’s). Deze aanpak is echter technisch uitdagend omdat het een differentiële spanningsklem vereist van twee tegenover elkaar staande eicellen die een gemeenschappelijke basis delen. Hoewel een klein aantal laboratoria erin is geslaagd deze techniek uit te voeren, hebben ze in wezen allemaal zelfgemaakte versterkers of commerciële versterkers gebruikt die zijn ontworpen voor opnames met één eicel. Het is vaak een uitdaging voor andere laboratoria om deze techniek te implementeren. Hoewel een hoge zijstroommeetmodus is opgenomen in een commerciële versterker voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen, was er tot onze recente studie geen rapport voor de toepassing ervan. We hebben de benadering van het meten van hoge zijstromen praktischer en handiger gemaakt door verschillende technische wijzigingen te introduceren, waaronder de constructie van een magnetisch gebaseerd opnameplatform dat nauwkeurige plaatsing van eicellen en verschillende elektroden mogelijk maakt, gebruik van de badoplossing als geleider in spannings differentiële elektroden, goedkeuring van een commerciële KCl-elektrode met lage lekkage als referentie-elektrode, fabricage van stroom- en spanningselektroden uit dunwandige glazen haarvaten en positionering van alle elektroden met behulp van magnetisch gebaseerde apparaten. De hier beschreven methode maakt handige en robuuste opnames van junctionele stroom (Ij) tussen twee tegengestelde Xenopus-eicellen mogelijk.
Introduction
GJs zijn intercellulaire kanalen die de stroomstroom en uitwisseling van kleine cytosolische moleculen tussen naburige cellen mogelijk maken. Ze bestaan in vele celtypen en vervullen verschillende fysiologische functies. Js bij gewervelde dieren worden gevormd door connexinen, terwijl die bij ongewervelde dieren worden gevormd door innexinen. Elke GJ bestaat uit twee naast elkaar geplaatste hemichannels met 6 of 8 subeenheden per hemikanaal, afhankelijk van of het connexinen of innexinenzijn 1,2,3. Mensen hebben 21 connexinegenen4, terwijl de veelgebruikte ongewervelde modellen C. elegans pt Drosophila melanogaster respectievelijk 25 en 8 innexinegenen hebben, respectievelijk 5,6. Alternatieve splicing van gentranscripten kan de diversiteit van GJ-eiwitten verder verhogen, althans voor innexinen 7,8.
GI’s kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën op basis van moleculaire samenstellingen: homotypisch, heterotypisch en heteromeer. Een homotypische GJ heeft al zijn subeenheden die identiek zijn. Een heterotypische GJ heeft twee homomere hemichannels, maar de twee hemichannels worden gevormd door twee verschillende GJ-eiwitten. Een heteromere GJ bevat ten minste één heteromeer hemikanaal. De moleculaire diversiteit van GI’s kan verschillende biofysische eigenschappen verlenen die belangrijk zijn voor hun fysiologische functies. GJ biofysische eigenschappen worden ook gemoduleerd door regulerende eiwitten9. Om te begrijpen hoe GI’s hun fysiologische functies uitvoeren, is het belangrijk om hun moleculaire samenstellingen, biofysische eigenschappen en de rol van regulerende eiwitten in hun functies te kennen.
Heterologe expressiesystemen worden vaak gebruikt om biofysische eigenschappen van ionkanalen, waaronder GI’s, en de effecten van regulerende eiwitten daarop te bestuderen. Omdat heterologe expressiesystemen de expressie van specifieke eiwitten mogelijk maken, zijn ze over het algemeen beter vatbaar voor het ontleden van eiwitfuncties dan inheemse weefsels, waar eiwitten met redundante functies de analyse kunnen bemoeilijken en registratie van Ij onbereikbaar kan zijn. Helaas zijn de meest gebruikte cellijnen behalve de Neuro-2A-cel niet geschikt voor het bestuderen van GJ biofysische eigenschappen als gevolg van complicaties door endogene connexinen. Zelfs Neuro-2A-cellen zijn niet altijd geschikt voor dit soort analyses. We konden bijvoorbeeld geen Ij detecteren in Neuro-2A-cellen getransfecteerd met de innexinen UNC-7 en UNC-9 in afwezigheid of aanwezigheid van UNC-1 (ongepubliceerd), wat nodig is voor de functie van UNC-9 GI’s in C. elegans 9,10. Aan de andere kant zijn Xenopus-eicellen een nuttig alternatief systeem voor elektrofysiologische analyses van GI’s. Hoewel ze een endogene GJ-eiwit tot expressie brengen, connexine 38 (Cx38)11, kunnen mogelijke complicaties gemakkelijk worden vermeden door een specifiek antisense oligonucleotide12 te injecteren. Analyses van JS met Xenopus-eicellen vereisen echter een differentiële spanningsklem van twee naast elkaar geplaatste cellen, wat technisch uitdagend is. De vroegste successen van dubbele spanningsklem van kikkerblastomeren werden ongeveer 40 jaar geleden gemeld 13,14. Sindsdien hebben veel studies deze techniek gebruikt om Ij vast te leggen in gepaarde Xenopus-eicellen. In wezen zijn echter alle voorgaande studies uitgevoerd met zelfgemaakte versterkers 12,15,16 of commerciële versterkers ontworpen voor opnames op enkele eicellen (GeneClamp 500, AxoClamp 2A of AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Omdat zelfs de commerciële versterkers geen instructies geven voor dubbele eicelspanningsklem, is het vaak een uitdaging voor nieuwe of minder geavanceerde elektrofysiologische laboratoria om deze techniek te implementeren.
Er is slechts één commerciële versterker ontwikkeld voor dubbele eicelspanningsklem, de OC-725C van Warner Instruments (Table of Materials, Figuur 1A). Deze versterker kan worden gebruikt in een standaardmodus (voor enkele eicellen) of een hoge zijstroommeetmodus (voor enkele of dubbele eicellen), afhankelijk van of er twee stopcontacten in de spanningsonde zijn aangesloten (figuur 1B, C). Tot onze recente studie7 was er echter geen enkele publicatie geweest die het gebruik van deze versterker in zijn hoge zijstroommeetmodus beschreef. Hoewel de versterker door een ander laboratorium is gebruikt voor dubbele eicelopnamen, werd deze gebruikt in de standaard in plaats van de hoge zijmodus21,22. Dit gebrek aan rapporten met behulp van de versterker in de hoge zijstroommeetmodus kan te wijten zijn aan technische problemen. We waren niet in staat om stabiele dubbele eicelopnamen te verkrijgen met behulp van de hoge zijmodus door de instructies van de fabrikant te volgen. In de loop der jaren hebben we drie verschillende benaderingen voor dubbele eicelopnamen geprobeerd, waaronder het gebruik van twee OC-725C-versterkers in de hoge zijstroommeetmodus, twee OC-725C-versterkers in de standaardmodus en twee versterkers van een andere fabrikant. Uiteindelijk is het ons gelukt om pas met de eerste aanpak na uitgebreid vallen en opstaan stabiele opnames te behalen. Deze publicatie beschrijft en demonstreert de procedures die we gebruiken om GJ-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen, Ij te registreren met behulp van de hoge zijstroommeetmodus en de elektrofysiologische gegevens te analyseren met behulp van populaire commerciële software. Aanvullende informatie over de dubbele spanningsklemtechniek is te vinden in andere publicaties19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systeemoptimalisatie lijkt noodzakelijk te zijn voor experimenten met dubbele oöcytspanningsklem. Zonder dit kunnen opnames zeer onstabiel zijn en moeten de versterkers mogelijk een overmatige hoeveelheid stroom injecteren om de doel-Vm te bereiken, wat resulteert in oöcytschade en opnamefouten. Verschillende factoren zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van stabiele dubbele eicelopnamen met de hoge zijstroommeetmethode. Ten eerste moeten de stroom- en spanningselektroden de juiste weerstand hebben (~ …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Haiying Zhan, Qian Ge voor hun betrokkenheid bij de eerste fase van de technische ontwikkeling, Kiranmayi Vedantham voor het helpen met de cijfers en Dr. Camillo Peracchia voor advies over de eicelparingskamer.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologia do Desenvolvimento. 156 (2), 490-499 (1993).
