Aqui apresentamos um protocolo para expressar proteínas de junção de lacunas em oócitos xenopus e gravar corrente juncional entre dois oócitos apposed usando um amplificador comercial projetado para gravações de tensão de oócito duplo em um modo de medição de corrente lateral alta.
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Artigo de método
Gravação gap junction current de Xenopus Oocytes
Neste artigo
Resumo
Resumo
A expressão heterologous de connexinas e innexins em Xenopus oócitos é uma abordagem poderosa para estudar as propriedades biofísicas das junções de lacunas (GJs). No entanto, essa abordagem é tecnicamente desafiadora porque requer um grampo de tensão diferencial de dois oócitos opostos compartilhando um terreno comum. Embora um pequeno número de laboratórios tenham conseguido executar essa técnica, essencialmente todos eles usaram amplificadores caseiros ou amplificadores comerciais que foram projetados para gravações de oócito único. É frequentemente desafiador para outros laboratórios implementar essa técnica. Embora um modo de medição de corrente lateral alta tenha sido incorporado em um amplificador comercial para gravações duplas de grampo de tensão oócito, não havia nenhum relatório para sua aplicação até nosso estudo recente. Tomamos a abordagem de medição de corrente lateral mais prática e conveniente introduzindo várias modificações técnicas, incluindo a construção de uma plataforma de gravação baseada magneticamente que permite a colocação precisa de oócitos e vários eletrodos, uso da solução de banho como condutor em eletrodos diferenciais de tensão, adoção de um eletrodo KCl comercial de baixa vazagem como eletrodo de referência, fabricação de eletrodos de corrente e tensão de capilares de vidro de parede fina, e posicionamento de todos os eletrodos usando dispositivos baseados magneticamente. O método descrito aqui permite gravações convenientes e robustas de corrente juncional (Ij) entre dois oócitos xenopus opostos .
Introdução
GJs são canais intercelulares que podem permitir o fluxo atual e a troca de pequenas moléculas citosóicas entre as células vizinhas. Eles existem em muitos tipos de células e desempenham diversas funções fisiológicas. GJs em vertebrados são formados por connexins, enquanto aqueles em invertebrados por innexinas. Cada GJ consiste em dois hemichannels justtaposed com 6 ou 8 subunidades por hemichannel, dependendo se são connexinas ou innexins 1,2,3. Os humanos têm 21 genes connexin4, enquanto os modelos invertebrados comumente usados C. elegans ....
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Protocolo
As cirurgias são realizadas seguindo um protocolo aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Connecticut.
1. Cirurgia de sapo e preparação de oócitos desfollicuados
- Anestesiar uma fêmea adulta de sapo africano (Xenopus laevis) (Tabela de Materiais) imergindo em uma solução tricaina fria (com gelo) (~300 mg/L).
- Espere (~15 min) até que o sapo mostre pouca ou nenhuma resposta para apertar seus pés de teia. Coloque o sapo em uma mesa de operação com sua barriga virada para cima.
- Depois de uma incisão longitudinal....
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Resultados
UNC-7 e UNC-9 são innexins de C. elegans. Enquanto o UNC-9 tem apenas uma isoforma, o UNC-7 tem isóformes múltiplos que diferem principalmente no comprimento e na sequência de aminoácidos de seus terminais de amino 7,8. Estas innexinas podem formar GJs homotípicos, bem como heteríticos (de UNC-7 e UNC-9) quando expressos em oócitos xenopus 7,8. Os traços representativos Ij.......
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Discussão
A otimização do sistema parece ser necessária para experimentos de grampo de tensão de oócito duplo. Sem ele, as gravações podem ser altamente instáveis, e os amplificadores podem ter que injetar uma quantidade excessiva de corrente para atingir o alvo Vm, resultando em danos oócitos e falhas de gravação. Vários fatores são fundamentais para a obtenção de gravações de oócito dupla estável com o método de medição de corrente lateral alta. Primeiro, os eletrodos de corrente e tensão devem ter resistência adequada .......
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Divulgações
Os autores não têm conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos a Haiying Zhan, Qian Ge por seu envolvimento na fase inicial de desenvolvimento técnico, Kiranmayi Vedantham por ajudar com os números, e dr. Camillo Peracchia por conselhos sobre a câmara de pareamento oócito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Suporte magnético de ponte de ágar | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | Mais estável do que o grampo de tubo Narishige devido à sua base magnética maior, mas requer modificação para acomodar um soquete fêmea de 2 mm. |
| Auto Injetor de Nanolitros | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, EUA | Nanoject II | Injetor automatizado de nanolitros |
| Colagenase, Tipo II | Gibco-EUA, Langley, OK, EUA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA | 62108-ST | |
| Sonda de Tensão Diferencial | Warner Instruments, Hamden, CT, EUA | 7255DI | |
| Conversor de Sinal Analógico-Digital | Molecular Devices, San Jose, CA, EUA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Pinças | World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA | 500341 | |
| Capilares de Vidro | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, EUA | 3-000-203-G/X | |
| Cortador de Fio Quente | Amazon.com | Proxxon 37080 | Uma alternativa é o Hercules 8500 DHWT, que possui um pedal de controle. |
| Hialuronidase, Tipo I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA | H3506 | |
| Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, EUA | MB-L-45 | ||
| Microeletrodo Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, EUA | BV-10 | |
| World Precision Instruments, , Sarasota, FL, EUA | Extrator de | ||
| Sutter Instrument, , Novato, CA, EUA | P-97 | ||
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, EUA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, EUA | U-CMN-1000 | |
| Amplificador de braçadeira de oócitos | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose, CA, EUA | Versão 10 | |
| Eletrodo de Referência | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Especificações: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (inibidor da ribonuclease) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Sutura de Seda 5-0 | Covidien, North Haven, CT, EUA | VS890 | |
| Espectrofotômetro NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Parede Fina Capallaries | World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Pronto para uso, mas sua posição é propensa a mudar devido à pequena base magnética. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, EUA | IMP-XL-FM |
Referências
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A reso....
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Reimpressões e permissões
