アフリカツメガエル卵母細胞からのギャップ接合電流の記録
Summary
ここでは、 アフリカツメガエル 卵母細胞でギャップ接合タンパク質を発現させ、ハイサイド電流測定モードでのデュアル卵母細胞電圧クランプ記録用に設計された商用アンプを使用して、2つのアポーズ卵母細胞間の接合電流を記録するプロトコルを紹介します。
Abstract
アフリカツメガエル卵母細胞におけるコネキシンおよびイネキシンの異種発現は、ギャップ接合部(GJ)の生物物理学的特性を研究するための強力なアプローチである。しかし、このアプローチは、共通のグランドを共有する2つの対向する卵母細胞の差動電圧クランプを必要とするため、技術的に困難です。少数の研究室がこの技術の実行に成功しましたが、本質的にそれらのすべては、単一の卵母細胞記録用に設計された自家製のアンプまたは市販のアンプのいずれかを使用しています。他のラボでは、この手法を実装することが困難な場合がよくあります。ハイサイド電流測定モードは、デュアル卵母細胞電圧クランプ記録用の商用アンプに組み込まれていますが、最近の研究までその適用に関する報告はありませんでした。我々は、卵母細胞および様々な電極の正確な配置を可能にする磁気ベースの記録プラットフォームの構築、電圧差動電極の導体としての浴液の使用、参照電極としての市販の低リークKCl電極の採用など、いくつかの技術的修正を導入することにより、ハイサイド電流測定アプローチをより実用的かつ便利にしました。 薄肉ガラスキャピラリーからの電流電極および電圧電極の作製、および磁気ベースのデバイスを使用したすべての電極の位置決め。ここで説明する方法は、2つの対向するアフリカツメガエル卵母細胞間の接合電流(Ij)の便利で堅牢な記録を可能にする。
Introduction
GJは、隣接する細胞間の小さな細胞質ゾル分子の電流の流れおよび交換を可能にし得る細胞間チャネルである。それらは多くの細胞型に存在し、多様な生理学的機能を果たす。脊椎動物のGJはコネキシンによって形成されるが、無脊椎動物のGJはイネキシンによって形成される。各GJは、コネキシンまたはイネキシン1,2,3であるかどうかに応じて、ヘミチャネルあたり6または8のサブユニットを有する2つの並置されたヘミチャネルからなる。ヒトは21のコネキシン遺伝子4を有し、一般的に使用される無脊椎動物モデルC. elegansおよびショウジョウバエメラノガスターは、それぞれ25および8個のイネキシン遺伝子を有する5,6を有する。遺伝子転写産物の選択的スプライシングは、少なくともイネキシン7、8について、GJタンパク質の多様性をさらに増加させ得る。
GJは、分子組成に基づいて、ホモタイプ、ヘテロタイプ、およびヘテロメリックの3つのカテゴリに分けることができる。ホモタイプGJは、そのすべてのサブユニットが同一である。ヘテロタイプGJは2つのホモマーヘミチャネルを有するが、2つのヘミチャネルは2つの異なるGJタンパク質によって形成される。ヘテロマーGJは、少なくとも1つのヘテロメリックヘミチャネルを含有する。GJの分子の多様性は、その生理学的機能にとって重要な明確な生物物理学的特性を付与する可能性がある。GJの生物物理学的特性もまた、調節タンパク質9によって調節される。GJが生理学的機能をどのように果たすかを理解するためには、GJの分子組成、生物物理学的特性、およびその機能における調節タンパク質の役割を知ることが重要です。
異種発現系は、GJを含むイオンチャネルの生物物理学的特性、およびそれらに対する調節タンパク質の影響を研究するためにしばしば使用される。異種発現系は特定のタンパク質の発現を可能にするため、冗長な機能を有するタンパク質が分析を複雑にする可能性があり、Ijの記録が達成不可能である可能性がある天然組織よりも、タンパク質機能を解剖するのに一般的に適している。残念なことに、Neuro-2A細胞を除いて最も一般的に使用される細胞株は、内因性コネキシンによる合併症のためにGJ生物物理学的特性を研究するのには不適切である。Neuro-2A細胞でさえ、この種の分析に必ずしも適しているとは限りません。例えば、C. elegans 9,10におけるUNC-9 GJの機能に必要なUNC-1(未発表)の非存在下または存在下で、イネキシンUNC-7およびUNC-9を導入したNeuro-2A細胞において、いかなるIjも検出できなかった。一方、アフリカツメガエル卵母細胞は、GJの電気生理学的分析のための有用な代替システムである。それらは内因性GJタンパク質、コネキシン38(Cx38)11を発現するが、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド12を注射することによって潜在的な合併症を容易に回避することができる。しかし、アフリカツメガエル卵母細胞を用いたGJの分析には、並置された2つの細胞の差動電圧クランプが必要であり、これは技術的に困難である。カエルの割球の二重電圧クランプの最も初期の成功は、約40年前に報告されました13,14.それ以来、多くの研究がこの技術を使用して、対をなすアフリカツメガエル卵母細胞でIjを記録してきました。しかしながら、本質的に以前の研究はすべて、自家製アンプ12,15,16または単一の卵母細胞上の記録用に設計された市販のアンプ(GeneClamp 500、AxoClamp 2A、またはAxoClamp 2B、Axon Instruments、ユニオンシティ、カリフォルニア州)8,17,18,19,20のいずれかを用いて実施されている。.市販のアンプでさえ二重卵母細胞電圧クランプの指示を提供していないため、新しい、またはそれほど洗練されていない電気生理学的ラボがこの技術を実装することはしばしば困難です。
ダブル卵母細胞電圧クランプ用に開発された商用アンプは、ワーナーインスツルメンツのOC-725C(材料表、図1A)のみです。このアンプは、電圧プローブの2つのソケットが接続されているかどうかに応じて、標準モード(単一卵母細胞の場合)またはハイサイド電流測定モード(単一または二重卵母細胞の場合)のいずれかで使用できます(図1B、C)。しかし、私たちの最近の研究7まで、ハイサイド電流測定モードでのこのアンプの使用を記述した出版物は1つもありませんでした。このアンプは、二重卵母細胞記録のために別の研究室によって使用されてきたが、ハイサイドモード21、22ではなく標準で使用された。このハイサイド電流測定モードでアンプを使用したレポートの欠如は、技術的な問題によるものかもしれません。製造元の指示に従って、ハイサイドモードを使用して安定した二重卵母細胞記録を得ることができませんでした。長年にわたり、デュアル卵母細胞記録には、ハイサイド電流測定モードで2つのOC-725Cアンプ、標準モードで2つのOC-725Cアンプ、および別のメーカーの2つのアンプを使用するなど、3つの異なるアプローチを試してきました。結局、長い試行錯誤の末、最初のアプローチで安定した録音を得ることに成功しました。この出版物は、アフリカツメガエル卵母細胞でGJタンパク質を発現し、ハイサイド電流測定モードを使用してIjを記録し、一般的な市販ソフトウェアを使用して電気生理学的データを分析するために使用する手順を説明および実証します。二重電圧クランプ技術に関する追加情報は、他の刊行物19、23に見出すことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
システムの最適化は、二重卵母細胞電圧クランプ実験に必要であると思われる。これがないと、記録が非常に不安定になり、アンプがターゲットVmに到達するために過剰な電流を注入しなければならず、卵母細胞の損傷と記録の失敗につながる可能性があります。ハイサイド電流測定法で安定した二重卵母細胞記録を得るためには、いくつかの要因が重要です。まず、電流電極と電圧?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Haiying Zhan氏、技術開発の初期段階に関与してくれたQian Ge氏、フィギュアの制作を手伝ってくれたKiranmayi Vedantham氏、卵母細胞ペアリングチャンバーに関するアドバイスをしてくれたCamillo Peracchia博士に感謝します。
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
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