제노푸스 난모세포로부터의 갭 접합 전류 기록
Summary
여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
제노푸스 난모세포에서 접합체와 이넥신의 이종성 발현은 갭 접합 (GJs)의 생물 물리학 적 특성을 연구하기위한 강력한 접근법입니다. 그러나이 접근법은 공통점을 공유하는 두 개의 대향하는 난모세포의 차동 전압 클램프가 필요하기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 소수의 실험실이이 기술을 성공적으로 수행했지만 본질적으로 모두 수제 증폭기 또는 단일 난모세포 녹음을 위해 설계된 상업용 증폭기를 사용했습니다. 다른 실험실에서이 기술을 구현하는 것은 종종 어렵습니다. 하이사이드 전류 측정 모드가 이중 난자 전압 클램프 기록을위한 상업용 증폭기에 통합되었지만 최근 연구까지 그 적용에 대한 보고서는 없었습니다. 우리는 난모세포 및 다양한 전극을 정밀하게 배치 할 수있는 자기 기반 기록 플랫폼 구축, 전압 차동 전극의 도체로서의 욕조 솔루션 사용, 상업용 저누설 KCl 전극을 기준 전극으로 채택하는 등 몇 가지 기술적 수정을 도입하여 하이 사이드 전류 측정 접근법을보다 실용적이고 편리하게 만들었습니다. 얇은 벽 유리 모세 혈관에서 전류 및 전압 전극을 제작하고 자기 기반 장치를 사용하여 모든 전극을 배치합니다. 여기에 설명 된 방법은 두 개의 대향하는 Xenopus 난자 사이의 접합 전류 (Ij)의 편리하고 강력한 기록을 가능하게합니다.
Introduction
GJ는 이웃 세포들 사이의 작은 세포질 분자의 전류 흐름 및 교환을 허용할 수 있는 세포간 채널이다. 그들은 많은 세포 유형에 존재하며 다양한 생리 기능을 수행합니다. 척추 동물의 GJ는 코넥신에 의해 형성되는 반면, 무척추 동물의 GJ는 이넥신에 의해 형성됩니다. 각 GJ는 이들이 연결관인지 또는 이넥신 1,2,3인지에 따라 반채널당 6개 또는 8개의 서브유닛을 갖는 두 개의 병치된 반채널로 구성된다. 인간은 21 개의 코넥신 유전자4를 가지고 있으며, 일반적으로 사용되는 무척추 동물 모델 C. elegans와 Drosophila melanogaster는 각각 25 및 8 개의 이넥신 유전자를 가지고 있으며 5,6 개가 있습니다. 유전자 전사체의 대안적인 스플라이싱은 적어도 이넥신 7,8에 대해 GJ 단백질의 다양성을 더욱 증가시킬 수 있다.
GJ는 분자 조성에 따라 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다 : 동형, 이형, 이종 및 이종이체. 호모타입 GJ는 모든 서브유닛이 동일하다. 이형형 GJ는 두 개의 호모머 반수채널을 갖지만, 두 개의 반쪽 채널은 두 개의 서로 다른 GJ 단백질에 의해 형성된다. 이질성 GJ는 적어도 하나의 이종이머 반수채널을 함유한다. GJ의 분자 다양성은 생리적 기능에 중요한 뚜렷한 생체물리학적 특성을 부여할 수 있다. GJ 생물물리학적 특성은 또한 조절 단백질9에 의해 조절된다. GJ가 생리적 기능을 수행하는 방법을 이해하려면 분자 구성, 생물 물리학 적 특성 및 기능에서 조절 단백질의 역할을 아는 것이 중요합니다.
이종 발현 시스템은 종종 GJ를 포함한 이온 채널의 생체 물리학 적 특성과 조절 단백질이 그들에 미치는 영향을 연구하는 데 사용됩니다. 이종 발현 시스템은 특정 단백질의 발현을 허용하기 때문에, 이들은 일반적으로 중복 기능을 갖는 단백질이 분석을 복잡하게 할 수 있고, Ij의 기록이 달성될 수 없는 천연 조직보다 단백질 기능을 해부하는 데 더 적합하다. 불행히도, Neuro-2A 세포를 제외한 가장 일반적으로 사용되는 세포주는 내인성 연결에 의한 합병증으로 인해 GJ 생물 물리학 적 특성을 연구하는 데 부적절합니다. Neuro-2A 세포조차도 이러한 종류의 분석에 항상 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 우리는 C. elegans 9,10에서 UNC-9 GJ의 기능에 필요한 UNC-1 (미공개)의 부재 또는 존재 중 하나에서 이넥신 UNC-7 및 UNC-9로 형질감염된 Neuro-2A 세포에서 어떠한 Ij도 검출할 수 없었다. 한편, 제노푸스 난모세포는 GJ의 전기생리학적 분석을 위한 유용한 대안 시스템이다. 이들은 내인성 GJ 단백질인 코넥신 38(Cx38)11을 발현하지만, 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드12를 주입함으로써 잠재적인 합병증을 쉽게 피할 수 있다. 그러나 Xenopus 난모세포를 가진 GJ의 분석은 두 개의 병치된 세포의 차동 전압 클램프를 필요로 하며, 이는 기술적으로 어려운 과제입니다. 개구리 블라스토미어의 이중 전압 클램프의 초기 성공은 약 40 년 전13,14 년보고되었습니다. 그 이후로, 많은 연구들이 짝을 이룬 제노푸스 난모세포에서 Ij를 기록하기 위해 이 기술을 사용했다. 그러나 본질적으로 이전의 모든 연구는 수제 증폭기 12,15,16 또는 단일 난모세포에서의 녹음을 위해 설계된 상업용 증폭기 (GeneClamp 500, AxoClamp 2A 또는 AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20으로 수행되었습니다. . 상업용 증폭기조차도 이중 난자 전압 클램프에 대한 지침을 제공하지 않기 때문에 새롭거나 덜 정교한 전기 생리학 실험실에서이 기술을 구현하는 것이 종종 어렵습니다.
이중 난모세포 전압 클램프용 상용 증폭기는 단 하나, 워너 인스트루먼츠의 OC-725C(재료 표, 그림 1A)용으로 개발되었습니다. 이 증폭기는 전압 프로브에 두 소켓이 연결되어 있는지 여부에 따라 표준 모드(단일 난모세포의 경우) 또는 하이사이드 전류 측정 모드(단일 또는 이중 난모세포의 경우)에서 사용할 수 있습니다(그림 1B, C). 그러나, 우리의 최근 연구7까지, 하이사이드 전류 측정 모드에서 이 증폭기의 사용을 설명하는 단일 간행물은 없었다. 증폭기는 이중 난자 기록을 위해 다른 실험실에서 사용되었지만 하이 사이드 모드21,22가 아닌 표준에서 사용되었습니다. 하이사이드 전류 측정 모드에서 증폭기를 사용하는 이러한 보고서 부족은 기술적 어려움 때문일 수 있습니다. 우리는 제조업체의 지침에 따라 하이 사이드 모드를 사용하여 안정적인 이중 난자 기록을 얻을 수 없었습니다. 수년에 걸쳐, 우리는 하이 사이드 전류 측정 모드에서 두 개의 OC-725C 증폭기, 표준 모드에서 두 개의 OC-725C 증폭기 및 다른 제조업체의 두 개의 증폭기를 사용하는 것을 포함하여 이중 난자 기록에 대한 세 가지 접근 방식을 시도했습니다. 우리는 결국 광범위한 시행 착오 후 첫 번째 접근 방식으로만 안정적인 녹음을 얻는 데 성공했습니다. 이 간행물은 Xenopus 난모세포에서 GJ 단백질을 발현하고, 하이사이드 전류 측정 모드를 사용하여 Ij를 기록하고, 널리 사용되는 상용 소프트웨어를 사용하여 전기생리학적 데이터를 분석하는 데 사용하는 절차를 설명하고 시연합니다. 이중 전압-클램프 기술에 대한 추가적인 정보는 다른 간행물19,23에서 찾을 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시스템 최적화는 이중 난모세포 전압 클램프 실험에 필요한 것으로 보입니다. 그것 없이는 기록이 매우 불안정 할 수 있으며 증폭기가 목표 Vm에 도달하기 위해 과도한 양의 전류를 주입해야 할 수 있으므로 난모세포 손상 및 기록 실패가 발생할 수 있습니다. 몇 가지 요인은 높은 측면 전류 측정 방법으로 안정적인 이중 난모세포 기록을 얻는 데 중요합니다. 첫째, 전류 및 전압 전극은 적절…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 개발의 초기 단계에 참여한 Haiying Zhan, Qian Ge, 수치를 도와 준 Kiranmayi Vedantham 및 난모세포 페어링 챔버에 대한 조언을 해준 Camillo Peracchia 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
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