Registrerer gapkryssstrøm fra Xenopus Oocytes
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke gapkryssproteiner i Xenopus oocytter og registrere koblingsstrøm mellom to appocytter ved hjelp av en kommersiell forsterker designet for doble oocyttspenningsklemmeopptak i en høy sidestrøm målemodus.
Abstract
Heterologt uttrykk for connexins og innexins i Xenopus oocytes er en kraftig tilnærming for å studere de biofysiske egenskapene til gapkryss (GJs). Denne tilnærmingen er imidlertid teknisk utfordrende fordi den krever en differensialspenningsklemme på to motsatte oocytter som deler en felles bakke. Selv om et lite antall laboratorier har lyktes med å utføre denne teknikken, har egentlig alle brukt enten hjemmelagde forsterkere eller kommersielle forsterkere som ble designet for enkeltoocyttopptak. Det er ofte utfordrende for andre laboratorier å implementere denne teknikken. Selv om en høy sidestrøm målemodus har blitt innlemmet i en kommersiell forsterker for doble oocyttspenningsklemmeopptak, hadde det ikke vært noen rapport for søknaden før vår nylige studie. Vi har gjort den høye sidestrømsmålemetoden mer praktisk og praktisk ved å introdusere flere tekniske modifikasjoner, inkludert bygging av en magnetisk basert opptaksplattform som muliggjør presis plassering av oocytter og ulike elektroder, bruk av badeløsningen som leder i spenningsdifferensialelektroder, vedtakelse av en kommersiell lavlekkasje KCl-elektrode som referanseelektrode, fabrikasjon av strøm- og spenningselektroder fra tynnveggede glasskapillærer, og posisjonering av alle elektrodene ved hjelp av magnetisk baserte enheter. Metoden beskrevet her tillater praktiske og robuste opptak av koblingsstrøm (Ij) mellom to motsatte Xenopus oocytter.
Introduction
GJs er intercellulære kanaler som kan tillate strømstrøm og utveksling av små cytosoliske molekyler mellom nærliggende celler. De eksisterer i mange celletyper og utfører forskjellige fysiologiske funksjoner. GJs i vertebrater dannes av connexins, mens de invertebrater av innexins. Hver GJ består av to sammenstilte hemichannels med enten 6 eller 8 underenheter per hemichannel, avhengig av om de er connexins eller innexins 1,2,3. Mennesker har 21 konnexingener4, mens de ofte brukte hvirvelløse modellene C. elegans og Drosophila melanogaster har henholdsvis 25 og 8 innexingener. Alternativ skjøting av gentranskripsjoner kan ytterligere øke mangfoldet av GJ-proteiner, i hvert fall for innexiner 7,8.
GJs kan deles inn i tre kategorier basert på molekylære komposisjoner: homotypisk, heterotypisk og hetermerisk. En homotypisk GJ har alle sine underenheter identiske. En heterotypisk GJ har to homomeriske hemichannels, men de to hemichannels er dannet av to forskjellige GJ-proteiner. En heteromerisk GJ inneholder minst ett heteromerisk hemichannel. De molekylære diversitetene til GJs kan gi distinkte biofysiske egenskaper som er viktige for deres fysiologiske funksjoner. GJ biofysiske egenskaper moduleres også av regulatoriske proteiner9. For å forstå hvordan GJs utfører sine fysiologiske funksjoner, er det viktig å kjenne deres molekylære sammensetninger, biofysiske egenskaper og rollene til regulatoriske proteiner i deres funksjoner.
Heterologe uttrykkssystemer brukes ofte til å studere biofysiske egenskaper til ionkanaler, inkludert GJs, og effekten av regulatoriske proteiner på dem. Fordi heteroologe uttrykkssystemer tillater uttrykk for spesifikke proteiner, er de generelt mer mottagelige for å dissekere proteinfunksjoner enn innfødte vev der proteiner med overflødige funksjoner kan komplisere analysen, og registrering av Ij kan være uoppnåelig. Dessverre er de mest brukte cellelinjene unntatt Neuro-2A-cellen upassende for å studere GJ biofysiske egenskaper på grunn av komplikasjoner ved endogene connexins. Selv Neuro-2A celler er ikke alltid egnet for denne typen analyse. For eksempel kunne vi ikke oppdage noen Ij i Neuro-2A-celler transfektert med innexins UNC-7 og UNC-9 i verken fravær eller tilstedeværelse av UNC-1 (upublisert), som kreves for funksjonen til UNC-9 GJs i C. elegans 9,10. På den annen side er Xenopus oocytter et nyttig alternativt system for elektrofysiologiske analyser av GJs. Selv om de uttrykker et endogent GJ-protein, konnexin 38 (Cx38)11, kan potensielle komplikasjoner lett unngås ved å injisere et spesifikt antisense oligonukleotid12. Analyser av GJs med Xenopus oocytter krever imidlertid en differensialspenningsklemme av to sammenstilte celler, noe som er teknisk utfordrende. De tidligste suksessene med dobbeltspenningsklemme av frosk blastomerer ble rapportert for ca 40 år siden13,14. Siden da har mange studier brukt denne teknikken til å spille inn Ij i parede Xenopus oocytter. Imidlertid har egentlig alle de tidligere studiene blitt utført med enten hjemmelagde forsterkere 12,15,16 eller kommersielle forsterkere designet for opptak på enkeltoocytter (GeneClamp 500, AxoClamp 2A eller AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA) 8,17,18,19,20 . Fordi selv de kommersielle forsterkere ikke gir instruksjoner for dobbel oocyttspenningsklemme, er det ofte utfordrende for nye eller mindre sofistikerte elektrofysiologiske laboratorier å implementere denne teknikken.
Bare en kommersiell forsterker er utviklet for dobbel oocyttspenningsklemme, OC-725C fra Warner Instruments (Materialbord, figur 1A). Denne forsterkeren kan brukes enten i standardmodus (for enkle oocytter) eller en målemodus med høy sidestrøm (for enkle eller doble oocytter) avhengig av om to kontakter i spenningssonden er tilkoblet (figur 1B, C). Men frem til vår nylige studie7 hadde det ikke vært en eneste publikasjon som beskrev bruken av denne forsterkeren i sin høye sidestrøm målemodus. Selv om forsterkeren har blitt brukt av et annet laboratorium for doble oocyttopptak, ble den brukt i standarden i stedet for høysidemodus21,22. Denne mangelen på rapporter som bruker forsterkeren i sin høye sidestrøm målemodus kan skyldes tekniske problemer. Vi klarte ikke å oppnå stabile doble oocyttopptak ved hjelp av høysidemodus ved å følge instruksjonene fra produsenten. Gjennom årene har vi prøvd tre forskjellige tilnærminger for doble oocyttopptak, inkludert bruk av to OC-725C-forsterkere i målemodus med høy sidestrøm, to OC-725C forsterkere i standardmodus og to forsterkere fra en annen produsent. Vi lyktes til slutt med å skaffe stabile opptak bare med den første tilnærmingen etter omfattende prøving og feiling. Denne publikasjonen beskriver og demonstrerer prosedyrene vi bruker for å uttrykke GJ-proteiner i Xenopus oocytter, registrere Ij ved hjelp av den høye siden nåværende målemodus, og analysere elektrofysiologiske data ved hjelp av populær kommersiell programvare. Ytterligere informasjon om dobbel spenningsklemmeteknikk finnes i andre publikasjoner 19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systemoptimalisering ser ut til å være nødvendig for doble oocyttspenningsklemmeeksperimenter. Uten det kan opptakene være svært ustabile, og forsterkerne må kanskje injisere for mye strøm for å nå målet VM, noe som resulterer i oocyttskader og opptaksfeil. Flere faktorer er avgjørende for å oppnå stabile doble oocyttopptak med den høye sidestrømsmålemetoden. For det første må strøm- og spenningselektrodene ha passende motstand (~ 1 MΩ), og holderne må være rene. For det andre må V<sub…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Haiying Zhan, Qian Ge for deres engasjement i den første fasen av teknisk utvikling, Kiranmayi Vedantham for å hjelpe med tallene, og Dr. Camillo Peracchia for råd om oocyttparingskammeret.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologia do Desenvolvimento. 156 (2), 490-499 (1993).
