Gravação gap junction current de Xenopus Oocytes
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para expressar proteínas de junção de lacunas em oócitos xenopus e gravar corrente juncional entre dois oócitos apposed usando um amplificador comercial projetado para gravações de tensão de oócito duplo em um modo de medição de corrente lateral alta.
Abstract
A expressão heterologous de connexinas e innexins em Xenopus oócitos é uma abordagem poderosa para estudar as propriedades biofísicas das junções de lacunas (GJs). No entanto, essa abordagem é tecnicamente desafiadora porque requer um grampo de tensão diferencial de dois oócitos opostos compartilhando um terreno comum. Embora um pequeno número de laboratórios tenham conseguido executar essa técnica, essencialmente todos eles usaram amplificadores caseiros ou amplificadores comerciais que foram projetados para gravações de oócito único. É frequentemente desafiador para outros laboratórios implementar essa técnica. Embora um modo de medição de corrente lateral alta tenha sido incorporado em um amplificador comercial para gravações duplas de grampo de tensão oócito, não havia nenhum relatório para sua aplicação até nosso estudo recente. Tomamos a abordagem de medição de corrente lateral mais prática e conveniente introduzindo várias modificações técnicas, incluindo a construção de uma plataforma de gravação baseada magneticamente que permite a colocação precisa de oócitos e vários eletrodos, uso da solução de banho como condutor em eletrodos diferenciais de tensão, adoção de um eletrodo KCl comercial de baixa vazagem como eletrodo de referência, fabricação de eletrodos de corrente e tensão de capilares de vidro de parede fina, e posicionamento de todos os eletrodos usando dispositivos baseados magneticamente. O método descrito aqui permite gravações convenientes e robustas de corrente juncional (Ij) entre dois oócitos xenopus opostos .
Introduction
GJs são canais intercelulares que podem permitir o fluxo atual e a troca de pequenas moléculas citosóicas entre as células vizinhas. Eles existem em muitos tipos de células e desempenham diversas funções fisiológicas. GJs em vertebrados são formados por connexins, enquanto aqueles em invertebrados por innexinas. Cada GJ consiste em dois hemichannels justtaposed com 6 ou 8 subunidades por hemichannel, dependendo se são connexinas ou innexins 1,2,3. Os humanos têm 21 genes connexin4, enquanto os modelos invertebrados comumente usados C. elegans e Drosophila melanogaster têm 25 e 8 genes innexin, respectivamente 5,6. O splicing alternativo de transcrições genéticas pode aumentar ainda mais a diversidade de proteínas GJ, pelo menos para innexins 7,8.
Os GJs podem ser divididos em três categorias baseadas em composições moleculares: homotípica, heterotípica e heteromérica. Um GJ homotípico tem todas as suas subunidades idênticas. Um GJ heterotípico tem dois hemichannels homomédicos, mas os dois hemicanais são formados por duas proteínas GJ diferentes. Um GJ heteromérico contém pelo menos um hemichannel heteromérico. As diversidades moleculares dos GJs podem conferir propriedades biofísicas distintas que são importantes para suas funções fisiológicas. As propriedades biofísicas da GJ também são moduladas pelas proteínas regulatórias9. Para entender como os GJs desempenham suas funções fisiológicas, é importante conhecer suas composições moleculares, propriedades biofísicas e os papéis das proteínas regulatórias em suas funções.
Sistemas de expressão heterologos são frequentemente usados para estudar propriedades biofísicas de canais de íons, incluindo GJs, e os efeitos das proteínas regulatórias sobre eles. Como sistemas de expressão heterologos permitem a expressão de proteínas específicas, eles geralmente são mais favoráveis à dissecação de funções proteicas do que os tecidos nativos onde proteínas com funções redundantes podem complicar a análise, e o registro de Ij pode ser inatingível. Infelizmente, as linhas celulares mais usadas, exceto a célula Neuro-2A, são inadequadas para estudar propriedades biofísicas GJ devido a complicações por connexinas endógenas. Mesmo as células Neuro-2A nem sempre são apropriadas para este tipo de análise. Por exemplo, não pudemos detectar nenhuma célula Ij em células Neuro-2A transfeinadas com as innexins UNC-7 e UNC-9 na ausência ou na presença de UNC-1 (inédito), o que é necessário para a função de GJs UNC-9 em C. elegans 9,10. Por outro lado, os oócitos xenopus são um sistema alternativo útil para análises eletrofisiológicas de GJs. Embora expressem uma proteína Endogensa GJ, connexin 38 (Cx38)11, complicações potenciais podem ser facilmente evitadas injetando um oligonucleotídeo antissamo-americano específico12. No entanto, análises de GJs com oócitos xenopus requerem um grampo de tensão diferencial de duas células justapostas, o que é tecnicamente desafiador. Os primeiros sucessos do grampo de dupla tensão de blastomeres de sapo foram relatados cerca de 40 anos atrás13,14. Desde então, muitos estudos têm usado essa técnica para gravar Ij em xenopus oócitos emparelhados. No entanto, essencialmente todos os estudos anteriores foram realizados com amplificadores caseiros 12,15,16 ou amplificadores comerciais projetados para gravações em oócitos únicos (GeneClamp 500, AxoClamp 2A ou AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Como mesmo os amplificadores comerciais não fornecem instruções para o grampo de tensão de oócito duplo, muitas vezes é desafiador para novos ou menos sofisticados laboratórios eletrofisiológicos implementarem essa técnica.
Apenas um amplificador comercial foi desenvolvido para grampo de tensão oólito duplo, o OC-725C da Warner Instruments (Tabela de Materiais, Figura 1A). Este amplificador pode ser usado em um modo padrão (para oócitos únicos) ou em um modo de medição de corrente lateral alta (para oócitos únicos ou duplos) dependendo se dois soquetes em sua sonda de tensão estão conectados (Figura 1B, C). No entanto, até nosso estudo recente7, não havia uma única publicação descrevendo o uso deste amplificador em seu modo de medição de corrente lateral alta. Embora o amplificador tenha sido usado por outro laboratório para gravações duplas de oócito, ele foi usado no padrão e não no modo lateral alto21,22. Essa falta de relatórios usando o amplificador em seu modo de medição de corrente lateral alta pode ser devido a dificuldades técnicas. Não conseguimos obter gravações estáveis de oócito duplo usando o modo lateral alto seguindo instruções do fabricante. Ao longo dos anos, tentamos três abordagens diferentes para gravações de oócitos duplos, incluindo o uso de dois amplificadores OC-725C no modo de medição de corrente lateral alta, dois amplificadores OC-725C no modo padrão e dois amplificadores de outro fabricante. Eventualmente conseguimos obter gravações estáveis apenas com a primeira abordagem após extensa tentativa e erro. Esta publicação descreve e demonstra os procedimentos que usamos para expressar proteínas GJ em oócitos xenopus, gravar Ij usando o modo de medição de corrente lateral alta e analisar os dados eletrofisiológicos usando software comercial popular. Podem ser encontradas informações adicionais sobre a técnica de grampo de dupla tensão em outras publicações19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
A otimização do sistema parece ser necessária para experimentos de grampo de tensão de oócito duplo. Sem ele, as gravações podem ser altamente instáveis, e os amplificadores podem ter que injetar uma quantidade excessiva de corrente para atingir o alvo Vm, resultando em danos oócitos e falhas de gravação. Vários fatores são fundamentais para a obtenção de gravações de oócito dupla estável com o método de medição de corrente lateral alta. Primeiro, os eletrodos de corrente e tensão devem te…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Haiying Zhan, Qian Ge por seu envolvimento na fase inicial de desenvolvimento técnico, Kiranmayi Vedantham por ajudar com os números, e dr. Camillo Peracchia por conselhos sobre a câmara de pareamento oócito.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
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