Inspelning av gapkorsningsström från Xenopus-oocyter
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att uttrycka gapkorsningsproteiner i Xenopus-oocyter och registrera korsningsström mellan två apposerade oocyter med hjälp av en kommersiell förstärkare avsedd för dubbla oocytespänningskläminspelningar i ett mätläge med hög sidoström.
Abstract
Heterologt uttryck av konnexiner och innexiner i Xenopus-oocyter är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera de biofysiska egenskaperna hos gapkorsningar (GJ). Detta tillvägagångssätt är dock tekniskt utmanande eftersom det kräver en differentiell spänningsklämma av två motsatta oocyter som delar en gemensam grund. Även om ett litet antal laboratorier har lyckats utföra denna teknik, har i princip alla använt antingen hemlagade förstärkare eller kommersiella förstärkare som var utformade för en-oocyte inspelningar. Det är ofta utmanande för andra laboratorier att implementera denna teknik. Även om ett mätläge med hög sidoström har införlivats i en kommersiell förstärkare för inspelningar av dubbla oocytespänningsklämmor, hade det inte funnits någon rapport för dess tillämpning förrän vår senaste studie. Vi har gjort mätmetoden för hög sidoström mer praktisk och bekväm genom att införa flera tekniska modifieringar, inklusive konstruktionen av en magnetiskt baserad inspelningsplattform som möjliggör exakt placering av oocyter och olika elektroder, användning av badlösningen som ledare i spänningsdifferentialelektroder, antagande av en kommersiell KCl-elektrod med lågt läckage som referenselektrod, tillverkning av ström- och spänningselektroder från tunnväggiga glaskapillärer och positionering av alla elektroder med hjälp av magnetiskt baserade anordningar. Metoden som beskrivs här möjliggör praktiska och robusta inspelningar av korsningsström (Ij) mellan två motsatta Xenopus-oocyter .
Introduction
GJs är intercellulära kanaler som kan möjliggöra strömflöde och utbyte av små cytosoliska molekyler mellan angränsande celler. De finns i många celltyper och utför olika fysiologiska funktioner. GJs hos ryggradsdjur bildas av konnexiner, medan de hos ryggradslösa djur av innexiner. Varje GJ består av två sammansatta hemikanaler med antingen 6 eller 8 underenheter per hemikanal, beroende på om de är konnexiner eller innexiner 1,2,3. Människor har 21 konnexingener4, medan de vanliga ryggradslösa modellerna C. elegans och Drosophila melanogaster har 25 respektive 8 innexingener, 5,6. Alternativ skarvning av gentranskript kan ytterligare öka mångfalden av GJ-proteiner, åtminstone för innexiner 7,8.
GJs kan delas in i tre kategorier baserade på molekylära kompositioner: homotypiska, heterotypiska och heteromeriska. En homotypisk GJ har alla dess underenheter identiska. En heterotypisk GJ har två homomera hemikanaler, men de två hemikanalerna bildas av två olika GJ-proteiner. En heteromerisk GJ innehåller minst en heteromerisk hemikanal. De molekylära mångfalderna hos GJs kan ge distinkta biofysiska egenskaper som är viktiga för deras fysiologiska funktioner. GJ biofysiska egenskaper moduleras också av reglerande proteiner9. För att förstå hur GJs utför sina fysiologiska funktioner är det viktigt att känna till deras molekylära kompositioner, biofysiska egenskaper och rollerna hos reglerande proteiner i deras funktioner.
Heterologa uttryckssystem används ofta för att studera biofysiska egenskaper hos jonkanaler, inklusive GJs, och effekterna av reglerande proteiner på dem. Eftersom heterologa uttryckssystem tillåter uttryck av specifika proteiner är de i allmänhet mer mottagliga för dissekering av proteinfunktioner än inhemska vävnader där proteiner med redundanta funktioner kan komplicera analysen, och registrering av Ij kan vara ouppnåelig. Tyvärr är de vanligaste cellinjerna utom Neuro-2A-cellen olämpliga för att studera GJ-biofysiska egenskaper på grund av komplikationer av endogena konnexiner. Även Neuro-2A-celler är inte alltid lämpliga för denna typ av analys. Till exempel kunde vi inte upptäcka några Ij i Neuro-2A-celler transfekterade med innexinerna UNC-7 och UNC-9 i antingen frånvaron eller närvaron av UNC-1 (opublicerad), vilket krävs för funktionen av UNC-9 GJs i C. elegans 9,10. Å andra sidan är Xenopus-oocyter ett användbart alternativt system för elektrofysiologiska analyser av GJs. Även om de uttrycker ett endogent GJ-protein, connexin 38 (Cx38)11, kan potentiella komplikationer lätt undvikas genom att injicera en specifik antisenseoligonukleotid12. Analyser av GJs med Xenopus-oocyter kräver dock en differentiell spänningsklämma av två sammansatta celler, vilket är tekniskt utmanande. De tidigaste framgångarna med dubbelspänningsklämma av grodblastomerer rapporterades för cirka 40 år sedan13,14. Sedan dess har många studier använt denna teknik för att registrera Ij i parade Xenopus-oocyter. I huvudsak alla tidigare studier har dock utförts med antingen hemlagade förstärkare 12,15,16 eller kommersiella förstärkare avsedda för inspelningar på enstaka oocyter (GeneClamp 500, AxoClamp 2A eller AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Eftersom även de kommersiella förstärkarna inte ger instruktioner för dubbel oocytespänningsklämma är det ofta utmanande för nya eller mindre sofistikerade elektrofysiologiska laboratorier att implementera denna teknik.
Endast en kommersiell förstärkare har utvecklats för dubbel oocytespänningsklämma, OC-725C från Warner Instruments (Table of Materials, Figur 1A). Denna förstärkare kan användas i antingen ett standardläge (för enstaka oocyter) eller ett högströmsmätningsläge (för enkla eller dubbla oocyter) beroende på om två uttag i spänningssonden är anslutna (figur 1B, C). Men fram till vår senaste studie7 hade det inte funnits en enda publikation som beskriver användningen av denna förstärkare i sitt höga sidoströmsmätläge. Även om förstärkaren har använts av ett annat laboratorium för dubbla oocyteinspelningar, användes den i standarden snarare än det höga sidoläget21,22. Denna brist på rapporter som använder förstärkaren i sitt högströmsmätningsläge kan bero på tekniska svårigheter. Vi kunde inte få stabila dubbla oocyteinspelningar med hjälp av det höga sidoläget genom att följa instruktionerna från tillverkaren. Under årens lopp har vi provat tre olika metoder för dubbla oocyteinspelningar, inklusive att använda två OC-725C-förstärkare i mätläget för hög sidoström, två OC-725C-förstärkare i standardläget och två förstärkare från en annan tillverkare. Vi lyckades så småningom få stabila inspelningar först med det första tillvägagångssättet efter omfattande försök och fel. Denna publikation beskriver och demonstrerar de procedurer vi använder för att uttrycka GJ-proteiner i Xenopus-oocyter, registrera Ij med hjälp av mätläget för hög sidoström och analysera elektrofysiologiska data med hjälp av populär kommersiell programvara. Ytterligare information om dubbelspänningsklämtekniken finns i andra publikationer19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systemoptimering verkar vara nödvändig för experiment med dubbla oocytespänningsklämmor. Utan det kan inspelningar vara mycket instabila, och förstärkarna kan behöva injicera en överdriven mängd ström för att nå målet Vm, vilket resulterar i oocyteskador och inspelningsfel. Flera faktorer är avgörande för att erhålla stabila dubbla oocyter med mätmetoden för hög sidoström. Först måste ström- och spänningselektroderna ha lämpligt motstånd (~ 1 MΩ), och deras hållare måste vara rena….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Haiying Zhan, Qian Ge för deras engagemang i det inledande skedet av den tekniska utvecklingen, Kiranmayi Vedantham för att hjälpa till med siffrorna och Dr. Camillo Peracchia för råd om oocyteparningskammaren.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
Referências
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Biologia do Desenvolvimento. 156 (2), 490-499 (1993).
