Génération et expansion de lignées tumorales de mésothéliome pleural malin primitif

Summary

L’objectif de cet article sur la méthode est de démontrer une méthodologie robuste et reproductible pour l’enrichissement, la génération et l’expansion des lignées cellulaires tumorales primaires à partir du mésothéliome pleural réséqué chirurgicalement.

Abstract

Les méthodologies actuelles pour l’expansion des lignées cellulaires tumorales primaires à partir de types de tumeurs rares font défaut. Ce protocole décrit des méthodes pour élargir les cellules tumorales primaires à partir d’un mésothéliome pleural malin (MPM) réséqué chirurgicalement en fournissant un aperçu complet du processus, de la digestion à l’enrichissement, à l’expansion, à la cryoconservation et à la caractérisation phénotypique. En outre, ce protocole introduit des concepts de génération de tumeurs qui peuvent être utiles pour plusieurs types de tumeurs tels que la trypsinisation différentielle et l’impact des méthodes de dissociation sur la détection des marqueurs de surface cellulaire pour la caractérisation phénotypique. La principale limite de cette étude est la sélection de cellules tumorales qui se développeront dans un système de culture bidimensionnel (2D). Des variantes de ce protocole, y compris des systèmes de culture tridimensionnels (3D), des suppléments de milieu, un revêtement de plaque pour améliorer l’adhérence et d’autres méthodes de désagrégation, pourraient améliorer cette technique et le taux de réussite global de l’établissement d’une ligne tumorale. Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode de base pour établir et caractériser les cellules tumorales de cette tumeur rare.

Introduction

Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur rare fortement associée à l’exposition à l’amiante. Bien que les approches basées sur l’immunothérapie aient montré des résultats encourageants, il y a peu d’options de traitement disponibles pour les patients qui développent cette maladie, et le taux de survie global à 5 ans est faible ^1,2. Des efforts sont en cours dans plusieurs établissements pour mieux comprendre cette maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles d’améliorer les résultats pour les patients. Bien qu’il existe plusieurs modèles murins de mésothéliome, l’accès aux cellules tumorales primaires du mésothéliome est plus limité³. L’expansion in vitro des cellules tumorales primaires du mésothéliome fournirait un système modèle précieux qui peut être utilisé pour étudier directement les cellules tumorales et leur interaction avec les cellules immunitaires autologues telles que les lymphocytes infiltrant les tumeurs. Bien qu’il y ait eu des rapports sur l’expansion des lignées de cellules tumorales du mésothéliome primaire, ceux-ci sont peu nombreux et ne fournissent pas de procédure opératoire standard détaillée (SOP). De plus, peu de lignées cellulaires sont disponibles auprès de sources commerciales telles que l’American Type Culture Collection (ATCC). Bien que la disponibilité des lignées tumorales primaires soit limitée, il a été démontré que les cellules tumorales peuvent être élargies à partir d’épanchements pleuraux et directement à partir du tissu ^{tumoral 4,5}. En outre, il a été démontré que les lignées cellulaires tumorales élargies préservent le profil moléculaire de la tumeur d’origine ^4,5,6.

Notre laboratoire étudie le microenvironnement tumoro-immunitaire de la MPM et a développé une méthode pour élargir les lignées de cellules tumorales MPM primaires à partir de cas réséqués chirurgicalement. Cette méthode est adaptée de notre expérience dans l’établissement de lignées cellulaires tumorales de mélanome métastatique primaire. L’objectif de ce travail est de fournir une approche détaillée et pratique de l’expansion de la ligne tumorale du mésothéliome primaire à l’aide d’un système de modèle 2D et d’un profilage phénotypique ultérieur. Compte tenu du succès récent des stratégies de blocage des points de contrôle ciblant CTLA4 et-1 dans le cadre de première ligne², la capacité de générer de nombreuses lignées tumorales primaires pourrait approfondir la compréhension des deux mécanismes de résistance intrinsèques de la tumeur et fournir un système modèle important pour évaluer la reconnaissance des lymphocytes T, approfondissant ainsi notre compréhension de la réponse immunitaire dans la MPM.

La principale limitation de ce protocole est que chaque tumeur contient un microenvironnement différent et qu’il existe un degré élevé de variabilité du succès de l’expansion. En outre, cette méthode sélectionne les cellules tumorales qui peuvent se développer dans un système de culture 2D. D’autres méthodes impliquant la production d’une culture sphéroïde ou organoïde 3D pourraient fournir une approche alternative qui pourrait permettre un taux d’expansion plus élevé ou entraîner la capacité de dériver des lignées cellulaires incapables de se développer dans un système 2D traditionnel. De telles cultures 3D se sont avérées utiles pour la génération de types de tumeurs difficiles à développer, par exemple le cancer du pancréas⁷.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institution Review Board (IRB) du MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas. Cela concerne les tumeurs MPM standard réséquées chirurgicalement enlevées après consentement éclairé. 1. Préparation des milieux de digestion tumorale et d’autres milieux associés Pour préparer un milieu de digestion tumorale, ajoutez 5 mL de 100 % de pen/streptocoque (pénicilline/streptomycine) à 500…

Representative Results

Pour déterminer la contamination par les fibroblastes des cultures à passage précoce, les cellules sont évaluées à l’aide d’un microscope à phase inversée afin d’identifier la fréquence des fibroblastes par rapport aux autres cellules adhérentes présentes. La figure 1 montre des exemples d’augmentation de la contamination par les fibroblastes de 80 % (figure 1A), de 50 % (figure 1B) et de 30 % (<strong class="xfig…

Discussion

Bien que ce protocole soit simple, il y a quelques étapes critiques qui doivent être suivies de près. Le gel précoce est important pour préserver la capacité de répéter le processus d’enrichissement des cellules tumorales en cas d’échec initial. La capacité d’évaluer la contamination fibroblastique par l’œil pour décider de la bonne technique de division et de famine des milieux est essentielle pour prévenir la prolifération des fibroblastes dans la culture. De plus, la méthode de trypsinisation d…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML