Generazione ed espansione delle linee tumorali primarie e maligne del mesotelioma pleurico

Summary

L’obiettivo di questo documento di metodo è dimostrare una metodologia robusta e riproducibile per l’arricchimento, la generazione e l’espansione di linee cellulari tumorali primarie da mesotelioma pleurico resecato chirurgicamente.

Abstract

Mancano le attuali metodologie per l’espansione delle linee cellulari tumorali primarie da tipi di tumore rari. Questo protocollo descrive i metodi per espandere le cellule tumorali primarie dal mesotelioma pleurico maligno (MPM) resecato chirurgicamente fornendo una panoramica completa del processo dalla digestione all’arricchimento, all’espansione, alla crioconservazione e alla caratterizzazione fenotipica. Inoltre, questo protocollo introduce concetti per la generazione di tumori che possono essere utili per più tipi di tumore come la tripsinizzazione differenziale e l’impatto dei metodi di dissociazione sulla rilevazione di marcatori di superficie cellulare per la caratterizzazione fenotipica. Il principale limite di questo studio è la selezione di cellule tumorali che si espanderanno in un sistema di coltura bidimensionale (2D). Variazioni a questo protocollo, inclusi sistemi di coltura tridimensionali (3D), integratori di supporti, rivestimento di piastre per migliorare l’adesione e metodi di disaggregazione alternativi, potrebbero migliorare questa tecnica e il tasso di successo complessivo della creazione di una linea tumorale. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo di base per stabilire e caratterizzare le cellule tumorali da questo raro tumore.

Introduction

Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore raro altamente associato all’esposizione all’amianto. Sebbene gli approcci basati sull’immunoterapia abbiano mostrato risultati incoraggianti, c’è una scarsità di opzioni di trattamento disponibili per i pazienti che sviluppano questa malattia e il tasso di sopravvivenza complessivo a 5 anni è basso ^1,2. Sono in corso sforzi in più istituzioni per comprendere meglio questa malattia e identificare nuovi bersagli terapeutici che possono migliorare i risultati dei pazienti. Mentre ci sono più modelli murini di mesotelioma, l’accesso alle cellule tumorali del mesotelioma primario è più limitato³. L’espansione in vitro delle cellule tumorali del mesotelioma primario fornirebbe un prezioso sistema modello che può essere utilizzato per studiare direttamente le cellule tumorali e la loro interazione con le cellule immunitarie autologhe come i linfociti infiltranti il tumore. Mentre ci sono state segnalazioni sull’espansione delle linee di cellule tumorali del mesotelioma primario, queste sono poche e non forniscono una procedura operativa standard dettagliata (SOP). Inoltre, poche linee cellulari sono disponibili da fonti commerciali come American Type Culture Collection (ATCC). Mentre la disponibilità di linee tumorali primarie è limitata, è stato dimostrato che le cellule tumorali possono essere espanse da versamenti pleurici e direttamente dal tessuto tumorale ^4,5. Inoltre, le linee cellulari tumorali espanse hanno dimostrato di preservare il profilo molecolare del tumore originale ^4,5,6.

Il nostro laboratorio sta studiando il microambiente immuno-tumorale del MPM e ha sviluppato un metodo per espandere le linee primarie di cellule tumorali MPM da casi resecati chirurgicamente. Questo metodo è adattato dalla nostra esperienza nello stabilire linee cellulari tumorali di melanoma metastatico primario. L’obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un approccio dettagliato e pratico all’espansione della linea tumorale del mesotelioma primario utilizzando un sistema di modelli 2D e la successiva profilazione fenotipica. Dato il recente successo delle strategie di blocco dei checkpoint mirate a CTLA4 e PD-1 nell’impostazione di prima linea², la capacità di generare molte linee tumorali primarie potrebbe favorire la comprensione di entrambi i meccanismi intrinseci di resistenza del tumore e fornire un importante sistema modello per valutare il riconoscimento delle cellule T, approfondendo così la nostra comprensione della risposta immunitaria nel MPM.

Il principale limite di questo protocollo è che ogni tumore contiene un microambiente diverso e c’è un alto grado di variabilità del successo dell’espansione. Inoltre, questo metodo seleziona le cellule tumorali che possono espandersi in un sistema di coltura 2D. Altri metodi che prevedono la produzione di una coltura sferoide o organoide 3D potrebbero fornire un approccio alternativo che potrebbe consentire un più alto tasso di successo di espansione o comportare la capacità di derivare linee cellulari che non sono in grado di espandersi in un sistema 2D tradizionale. Tali colture 3D hanno dimostrato di essere utili per la generazione di tipi di tumore che sono difficili da espandere, ad esempio il cancro del pancreas⁷.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Institution Review Board (IRB) dell’Università del Texas MD Anderson Cancer Center. Ciò riguarda i tumori MPM standard-of-care, resecati chirurgicamente, rimossi a seguito del consenso informato. 1. Preparazione dei mezzi di digestione tumorale e di altri mezzi associati Per preparare i mezzi di digestione tumorale, aggiungere 5 ml di 100% Pen/Strep (Penicillina/Streptomicina) a 500 mL di mezzo sterile Roswell …

Representative Results

Per determinare la contaminazione dei fibroblasti delle colture a passaggio precoce, le cellule vengono valutate utilizzando un microscopio a fase invertita per identificare la frequenza dei fibroblasti rispetto alle altre cellule aderenti presenti. La Figura 1 mostra esempi di aumento della contaminazione da fibroblasti dell’80% (Figura 1A), del 50% (Figura 1B) e del 30% (Figura 1C), rispetto a una col…

Discussion

Mentre questo protocollo è semplice, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguiti da vicino. Il congelamento del passaggio precoce è importante per preservare la capacità di ripetere il processo di arricchimento delle cellule tumorali se inizialmente non ha successo. La capacità di valutare la contaminazione fibroblastica ad occhio per decidere la corretta tecnica di scissione e fame dei media è vitale per prevenire la crescita eccessiva dei fibroblasti nella coltura. Inoltre, il metodo di tripsinizzazi…

Materials

10 mL serological pipettes	BD Falcon	357551
15 mL conical tubes	BD Falcon	352097
2 mL aspirating pipettes	BD Falcon	357558
5 mL serological pipettes	BD Falcon	357543
50 mL conical tubes	BD Falcon	352098
6-well microplates, tissue culture treated	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry.
anti-CD325 (N-Cadherin) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
anti-Mesothelin APC	Miltenyi	130-118-096
Bovine Serum Albumin 30%	Sigma	A8577-1L
Cell Dissociation buffer, enzyme-free	Thermo Fisher Scientific	13151014
Cell strainer (70 µm)	Greiner Bio-One	542-070
Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors
Collagenase Type 1	Sigma-Aldrich	C-0130	Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C.
Controlled-rate freezing chamber	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	White, opaque 96-well microplate.
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
DNAse I (from bovine pancreas)	Sigma-Aldrich	D4527	Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month.
Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS tubes-filter top	BD Falcon	352235
Fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C-tubes	Miltenyi	130-093-237
GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus	Miltenyi	130-096-427	Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation.
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023	Aliquot and store at -20 °C.
Hank's Balanced Salt solution, 500 mL	Corning	MT21022CV
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C.
Inverted-phase microscope
Laminar flow hood
Live/dead yellow dye	Life Technologies	L-34968
Micropipettor tips, 20 µL	ART	2149P
Micropipettor, 0.5-20 µL
Mycoalert assay control set	Lonza	LT07-518	Aliquot positive controls and store at -20 °C.
Mycoalert Plus mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-710	Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C.
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C.
Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL	Gibco	15140-122
Pipet aid
Plate reader with luminescent capabilities	BioTek	Synergy HT	any plate reader with these specifications can be used
RPMI 1640 media	Corning	10-040-CV
Scalpel	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
Sterile forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25 flasks, tissue culture treated	Corning	430639
T75 flasks, tissue culture treated	Corning	430641U
Trypan blue solution 0.4%	Gibco	15250-061
Trypsin EDTA 0.05%	Corning	25-052-CI
ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution	Nexcelom	CS2-0106-5ML