비방사성 철 동위원소를 사용한 생체 내 마우스 태반을 가로지르는 철 수송 정량화
Summary
이 기사는 마우스 임신에서 철 수송 연구를 위해 트랜스페린 결합 비 방사성 동위 원소 철을 준비하고 투여하는 방법을 보여줍니다. 태아 태반 구획에서 동위 원소 철을 정량화하는 접근법도 설명됩니다.
Abstract
철분은 임신 중 산모와 태아의 건강에 필수적이며, 건강한 임신을 유지하기 위해 인간에게 약 1g의 철분이 필요합니다. 태아의 철분 기증은 태반을 가로지르는 철분 전달에 전적으로 의존하며, 이러한 전달의 섭동은 불리한 임신 결과를 초래할 수 있습니다. 생쥐에서 태반을 가로지르는 철 플럭스의 측정은 전통적으로 방사성 철 동위원소에 의존했는데, 이는 매우 민감하지만 부담스러운 접근 방식이었습니다. 안정한 철 동위 원소 (57Fe 및 58Fe)는 인간 임신 연구에 사용하기위한 비 방사성 대안을 제공합니다.
생리 학적 조건 하에서, 트랜스페린 결합 철은 태반에 의해 흡수되는 철분의 주된 형태입니다. 따라서 58Fe- 트랜스페린을 준비하고 임신 한 댐에 정맥 주사하여 태반 철 수송을 직접 평가하고 모체 장 철분 흡수를 교란 변수로 우회했습니다. 동위원소 철은 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)에 의해 태반 및 마우스 배아 조직에서 정량화되었다. 이들 방법은 또한 생체내 철 동력학을 정량화하기 위해 생리학 또는 질병의 다른 동물 모델 시스템에서 사용될 수 있다.
Introduction
철분은 성장과 발달, 에너지 생산, 산소 수송을 포함한 다양한 대사 과정에 중요합니다1. 철 항상성의 유지는 역동적이고 조정 된 과정입니다. 철분은 십이지장의 음식에서 흡수되어 철 수송 단백질 트랜스페린 (Tf)에 결합 된 순환을 통해 몸 전체로 운반됩니다. 그것은 효소 과정을 위해 모든 세포에 의해 활용되고, 초기 적혈구의 헤모글로빈에 통합되고, 대 식세포에 의해 노화 된 적혈구에서 재활용됩니다. 철분은 과도하게 간장에 저장되고 출혈이나 세포 박리를 통해 신체에서 손실됩니다. 순환하는 철분의 양은 철분 소비와 공급 사이의 균형의 결과이며, 후자는 철 항상성1의 중앙 조절 자 인 간 호르몬 헵시딘 (HAMP)에 의해 엄격하게 조절됩니다. 헵시딘은 유비퀴틴화를 폐색 또는 유도하고 철 수출업자 페로포르틴(FPN)을 분해하여 혈액 내 철 생체 이용률을 제한하는 기능을 합니다.2. 기능성 FPN의 감소는 식이 철분 흡수 감소, 간에서의 철분 격리 및 대식세포로부터의 철 재활용 감소로이어집니다1.
헵시딘은 철분 상태, 염증, 적혈구 생성 드라이브 및 임신에 의해 조절됩니다 (3에서 검토 됨). 철 항상성이 매우 역동적이라는 점을 감안할 때 총 철 풀과 철 분포 및 회전율을 이해하고 측정하는 것이 중요합니다. 동물 연구는 전통적으로 방사성 철 동위 원소에 의존했는데, 이는 철 역학을 측정하는 데 매우 민감하지만 부담스러운 접근 방식입니다. 그러나 여기에 제시된 연구4를 포함한보다 최근의 연구에서는 비 방사성, 안정한 철 동위 원소 (58Fe)가 임신 중 철 수송을 측정하는 데 사용됩니다 5,6,7,8,9. 안정 동위 원소는 영양소 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다 (10에서 검토 됨). 인간 연구에서 안정한 철 동위 원소의 사용은 i) 임신 말기에 철 흡수가 증가하고, 5,6, ii)식이 철분의 태아로의 전달은 산모의철분 상태에 의존하며, iii) 산모가 섭취 한 헴철은 비헴 철보다 태아에 의해 더 쉽게 통합되며, iv) 태아로의 철분 전달은 모체 헵시딘 수치8와 음의 상관 관계가 있음을 입증했으며, 9. 이 실험은 혈청의 철 동위 원소 또는 적혈구로의 통합을 측정했습니다. 그러나 적혈구에 통합된 철의 측정만으로는 진정한철 흡수를 과소평가할 수 있습니다9. 현재 연구에서는 헴철과 비헴철이 모두 조직에서 측정됩니다.
임신 중에는 산모의 적혈구 부피 확장을 지원하고 태아의 성장과 발달을 지원하기 위해 태반을 가로질러 전달하기 위해 철분이 필요합니다11. 태아의 철 자질은 태반을 가로지르는 철 수송에 전적으로 의존한다. 인간 12 및 설치류 4,13 임신 동안 헵시딘 수치가 급격히 감소하여 태아에게 전달하기위한 혈장 철분 가용성이 증가합니다.
태반 철 수송의 기본은 방사성 추적자 (59Fe 및 55Fe)를 사용하여 1950-70 년대에 처음 특성화되었습니다. 이 연구는 태반을 가로 지르는 철 수송이 단방향14,15이고 이연 트랜스페린이 태반과 태아16,17의 주요 철분 공급원임을 확인했습니다. 태반 철 수송에 대한 현재의 이해는 더 완벽하지만 일부 주요 철 수송 체와 규제 메커니즘은 아직 알려지지 않았습니다. 마우스 모델은 철 조절과 수송을 이해하는 데 필수적이었습니다18 주요 수송 체와 메커니즘이 현저하게 유사하기 때문입니다. 인간 및 마우스 태반 모두는 hemochorial, 즉, 모체 혈액이 태아 chorion19와 직접 접촉한다. 그러나 몇 가지 주목할만한 구조적 차이가 있습니다.
세포 융합 영양성 세포는 산모와 태아의 순환을 분리하고 철분 및 기타 영양소를 적극적으로 운반하는 태반 세포층입니다20. 인간에서 세포 융합 성 영양 세포는 융합 된 세포의 단일 층입니다. 대조적으로, 마우스 태반은 2개의 세포융합 영양성 층(21), Syn-I 및 Syn-II로 구성된다. 그러나, Syn-I 및 Syn-II의 계면에서의 갭 접합은 층들(22, 23) 사이의 영양분의 확산을 허용한다. 따라서, 이들 층은 인간 세포 융합 영양성 세포와 유사한 단일 세포 융합 층으로서 기능한다. 인간과 마우스 태반 사이의 추가적인 유사점 및 차이점은 Rossant 및 Cross21에 의해 검토됩니다. 태반 철 수송은 모체 혈액에서 세포 융합 성 영양 세포24의 정점 쪽에 국한된 트랜스페린 수용체 (TfR1)로의 철 -Tf의 결합에 의해 유발됩니다. 이 상호 작용은 클라 트린 매개 세포 내 이입25를 통해 철 -Tf / TfR1 내재화를 유도합니다. 그런 다음 철은 산성 엔도솜26의 Tf에서 방출되고, 미확인 페리환원효소에 의해 철철로 환원되고, 아직 결정되지 않은 수송체에 의해 엔도솜에서 세포질로 내보내집니다. 동합성 영양성 세포 내에서 철분이 어떻게 보호되는지도 설명해야 합니다. 철은 결국 철 수출업자 인 FPN에 의해 태아 측으로 운반되며, 이는 세포 융합 성 영양 세포의 기저 또는 태아 대면 표면에 국한된다 (27에서 검토).
TfR1, FPN 및 헵시딘의 생리학적 및 병리학적 조절이 태반 철 수송에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 안정한 철 동위원소를 활용하여 모체 순환에서 태반 및 배아로의 철 수송을 생체 내4로 정량화했습니다. 이 논문은 임신 한 마우스에 동위 원소 철-트랜스페린을 제조 및 투여하고, ICP-MS를위한 조직을 처리하고, 조직의 철 농도를 계산하는 방법을 제시합니다. 생체 내에서 안정한 철 동위원소의 사용은 생리학적 및 병리학적 철 조절을 조사하기 위해 다양한 동물 모델에서 철 조절 및 분포를 조사하는 데 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
철분은 많은 생물학적 과정에 중요하며 신체 내에서의 움직임과 분포는 매우 역동적이고 규제됩니다. 안정한 철 동위 원소는 철 항상성의 역학 평가를위한 방사성 동위 원소에 대한 일관되고 편리한 대안을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 모든 조직 무게와 부피를 추적하는 것입니다. 철은 원소이므로 합성하거나 분해할 수 없습니다. 따라서 모든 무게와 부피를 주의 깊게 기록하면 시스?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 58Fe 측정을위한 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 받기 위해 UCLA의 CNSI에있는 나노 기술의 환경 영향을위한 UC 센터 내에서 ICP-MS 시설을 사용했음을 인정합니다. 이 연구는 NIH 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK) (K01DK127004, VS) 및 NIH 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NICHD) (R01HD096863, EN)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
Referências
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