Quantifizierung des Eisentransports über die Mausplazenta in vivo unter Verwendung nichtradioaktiver Eisenisotope
Summary
Dieser Artikel zeigt, wie transferringebundenes nichtradioaktives Isotopeneisen für Studien zum Eisentransport in der Mausschwangerschaft vorbereitet und verabreicht wird. Der Ansatz zur Quantifizierung von isotopischem Eisen in fetoplazentaren Kompartimenten wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
Eisen ist essentiell für die Gesundheit von Mutter und Fötus während der Schwangerschaft, wobei etwa 1 g Eisen beim Menschen benötigt wird, um eine gesunde Schwangerschaft aufrechtzuerhalten. Die fetale Eisenausstattung hängt vollständig vom Eisentransfer über die Plazenta ab, und Störungen dieses Transfers können zu nachteiligen Schwangerschaftsergebnissen führen. Bei Mäusen beruhte die Messung des Eisenflusses über die Plazenta traditionell auf radioaktiven Eisenisotopen, ein hochempfindlicher, aber belastender Ansatz. Stabile Eisenisotope (57Fe und 58Fe) bieten eine nichtradioaktive Alternative für den Einsatz in Schwangerschaftsstudien beim Menschen.
Unter physiologischen Bedingungen ist transferringebundenes Eisen die vorherrschende Form von Eisen, das von der Plazenta aufgenommen wird. So wurde 58Fe-Transferrin hergestellt und intravenös in schwangere Muttertiere injiziert, um den Plazenta-Eisentransport direkt zu beurteilen und die mütterliche Eisenabsorption im Darm als Störvariable zu umgehen. Isotopisches Eisen wurde in den embryonalen Geweben der Plazenta und der Maus mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) quantifiziert. Diese Methoden können auch in anderen Tiermodellsystemen der Physiologie oder Krankheit eingesetzt werden, um die Eisendynamik in vivo zu quantifizieren.
Introduction
Eisen ist entscheidend für verschiedene Stoffwechselprozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung, Energieproduktion und Sauerstofftransport1. Die Aufrechterhaltung der Eisenhomöostase ist ein dynamischer, koordinierter Prozess. Eisen wird aus der Nahrung im Zwölffingerdarm aufgenommen und im Kreislauf, der an das Eisentransportprotein Transferrin (Tf) gebunden ist, durch den Körper transportiert. Es wird von jeder Zelle für enzymatische Prozesse verwendet, in Hämoglobin in entstehende Erythrozyten eingebaut und von Makrophagen aus gealterten Erythrozyten recycelt. Eisen wird in der Leber gespeichert, wenn es im Übermaß ist und durch Blutungen oder Zellablösung aus dem Körper verloren geht. Die Menge an zirkulierendem Eisen ist das Ergebnis des Gleichgewichts zwischen dem Verbrauch und der Versorgung mit Eisen, wobei letzteres durch das Leberhormon Hepcidin (HAMP), den zentralen Regulator der Eisenhomöostase1, streng reguliert wird. Hepcidin begrenzt die Bioverfügbarkeit von Eisen im Blut, indem es die Ubiquitinierung verdeckt oder induziert und den Eisenexporteur Ferroportin (FPN) abbaut2. Die Verringerung des funktionellen FPN führt zu einer verminderten Eisenaufnahme in der Nahrung, Eisensequestrierung in der Leber und vermindertem Eisenrecycling aus Makrophagen1.
Hepcidin wird durch Eisenstatus, Entzündung, erythropoetischen Antrieb und Schwangerschaft reguliert (überprüft in 3). Da die Eisenhomöostase sehr dynamisch ist, ist es wichtig, den gesamten Eisenpool und die Eisenverteilung und den Eisenumsatz zu verstehen und zu messen. Tierstudien stützten sich traditionell auf radioaktive Eisenisotope, ein hochempfindlicher, aber belastender Ansatz zur Messung der Eisendynamik. In neueren Studien, einschließlich der hier vorgestellten Studie4, werden jedoch nichtradioaktive, stabile Eisenisotope (58Fe) verwendet, um den Eisentransport während der Schwangerschaft zu messen 5,6,7,8,9. Stabile Isotope sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung des Nährstoffstoffwechsels (überprüft in 10). Die Verwendung stabiler Eisenisotope in Humanstudien zeigte, dass i) die Eisenabsorption gegen Ende der Schwangerschaft zunimmt5,6, ii) die Übertragung von Eisen in die Nahrung zum Fötus vom mütterlichen Eisenstatus abhängt7, iii) mütterlich aufgenommenes Hämeisen vom Fötus leichter aufgenommen wird als Nicht-Häm-Eisen 8 und iv) der Eisentransfer zum Fötus negativ mit dem mütterlichen Hepcidinspiegel 8 korreliert, 9. Diese Experimente maßen Eisenisotope in Seren oder deren Einbau in Erythrozyten; Die Messung von Eisen, das allein in Erythrozyten eingebaut ist, kann jedoch die tatsächliche Eisenabsorption unterschätzen9. In der aktuellen Studie werden sowohl Häm- als auch Nicht-Häm-Eisen in Geweben gemessen.
Während der Schwangerschaft wird Eisen benötigt, um die Ausdehnung des mütterlichen Volumens der roten Blutkörperchen zu unterstützen und über die Plazenta zu übertragen, um das Wachstum und die Entwicklung des Fötuszu unterstützen 11. Die fetale Eisenausstattung hängt vollständig vom Eisentransport über die Plazenta ab. Während der Schwangerschaft von12 und Nagetieren 4,13 sinkt der Hepcidinspiegel dramatisch ab, wodurch die Verfügbarkeit von Plasmaeisen für den Transfer zum Fötus erhöht wird.
Die Grundlagen des Plazenta-Eisentransports wurden erstmals in den 1950er-70er Jahren mit radioaktiven Tracern (59Fe und 55Fe) charakterisiert. Diese Studien ergaben, dass der Eisentransport durch die Plazenta unidirektionalist 14,15 und dass Diferric Transferrin eine Hauptquelle für Eisen für die Plazenta und den Fötus16,17 ist. Das derzeitige Verständnis des Plazenta-Eisentransports ist vollständiger, obwohl einige wichtige Eisentransporter und Regulationsmechanismen unbekannt sind. Mausmodelle waren für das Verständnis der Eisenregulation und des Eisentransports unerlässlich18, da die wichtigsten Transporter und Mechanismen bemerkenswert ähnlich sind. Sowohl menschliche als auch Mausplazenta sind hämochororisch, dh mütterliches Blut steht in direktem Kontakt mit dem fetalen Chorion19. Es gibt jedoch einige bemerkenswerte strukturelle Unterschiede.
Der Synzytiotrophoblast ist die Plazentazellschicht, die den mütterlichen und fetalen Kreislauf trennt und aktiv Eisen und andere Nährstoffe transportiert20. Beim Menschen ist der Synzytiotrophoblast eine einzelne Schicht verschmolzener Zellen. Im Gegensatz dazu besteht die Mausplazenta aus zwei Synzytiotrophoblastschichten21, Syn-I und Syn-II. Gap Junctions an der Grenzfläche von Syn-I und Syn-II ermöglichen jedoch die Diffusion von Nährstoffen zwischen den Schichten22,23. Somit funktionieren diese Schichten als eine einzige Synzytialschicht, ähnlich dem menschlichen Synzytiotrophoblasten. Weitere Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen menschlichen und Maus-Plazenta werden von Rossant und Cross21 überprüft. Der plazentale Eisentransport wird durch die Bindung von Eisen-Tf aus dem mütterlichen Blut an den Transferrinrezeptor (TfR1) ausgelöst, der auf der apikalen Seite des Synzytiotrophoblasten24 lokalisiert ist. Diese Wechselwirkung induziert eine Eisen-Tf/TfR1-Internalisierung über Clathrin-vermittelte Endozytose25. Eisen wird dann aus Tf im sauren Endosom26 freigesetzt, durch eine unbestimmte Ferrireduktase zu Eisen reduziert und durch einen noch zu bestimmenden Transporter aus dem Endosom in das Zytoplasma exportiert. Wie Eisen innerhalb des Synzytiotrophoblasten begleitet wird, muss ebenfalls noch beschrieben werden. Eisen wird schließlich vom Eisenexporteur FPN auf die fetale Seite transportiert, lokalisiert auf der basalen oder fötalen Oberfläche des Synzytiotrophoblasten (überprüft in27).
Um zu verstehen, wie die physiologische und pathologische Regulation von TfR1, FPN und Hepcidin den Plazenta-Eisentransport beeinflusst, wurden stabile Eisenisotope verwendet, um den Eisentransport vom mütterlichen Kreislauf zur Plazenta und zum Embryo in vivo zu quantifizieren 4. In diesem Artikel werden die Methoden zur Herstellung und Verabreichung von isotopischem Eisentransferrin an trächtige Mäuse, zur Verarbeitung von Geweben für ICP-MS und zur Berechnung der Eisenkonzentrationen in Geweben vorgestellt. Die Verwendung stabiler Eisenisotope in vivo kann angepasst werden, um die Eisenregulation und -verteilung in verschiedenen Tiermodellen zu untersuchen, um die physiologische und pathologische Eisenregulation zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eisen ist wichtig für viele biologische Prozesse, und seine Bewegung und Verteilung im Körper sind hochdynamisch und reguliert. Stabile Eisenisotope bieten eine konsistente und bequeme Alternative zu radioaktiven Isotopen zur Beurteilung der Dynamik der Eisenhomöostase. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Verfolgung aller Gewebegewichte und -volumina. Eisen ist ein Element und kann daher weder synthetisiert noch abgebaut werden. Wenn also alle Gewichte und Volumina sorgfältig protokolliert werden, kann das ge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die Nutzung der ICP-MS-Einrichtung innerhalb des UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology in CNSI an der UCLA für ihre Unterstützung bei der Optimierung des Protokolls für 58Fe-Messungen. Die Studie wurde vom NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, bis VS) und NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, bis EN) unterstützt.
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
Referências
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