वयस्क चूहों से तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस में ऑक्सीजन की खपत दर का मापन
Summary
ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए एक सामान्य प्रॉक्सी है और इसका उपयोग विभिन्न रोग मॉडल का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हमने वयस्क चूहों से तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को सीधे मापने के लिए सीहॉर्स एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके एक नई विधि विकसित की है जो अन्य तरीकों की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर एटीपी उत्पादन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के विनियमन और सीए2 + एकाग्रता नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता को पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग और अल्जाइमर रोग सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के रोगजनन में फंसाया गया है। इन बीमारियों के मॉडल में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, हम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए प्रॉक्सी के रूप में ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को माप सकते हैं। ओसीआर को पहले से ही सेल संस्कृतियों में सफलतापूर्वक मापा गया है, साथ ही पृथक माइटोकॉन्ड्रिया भी। हालांकि, ये तकनीक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में ओसीआर को मापने की तुलना में कम शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, लेखकों ने वयस्क चूहों से तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को सीधे मापने के लिए सीहॉर्स एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके एक नई विधि विकसित की। तकनीक को स्ट्रिएटम पर ध्यान केंद्रित करने के साथ अनुकूलित किया गया है, जो पीडी और हंटिंगटन रोग में शामिल मस्तिष्क क्षेत्र है। विश्लेषक 24-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके एक लाइव सेल परख करता है, जो 24 नमूनों के एक साथ गतिज माप की अनुमति देता है। विधि नमूने के रूप में स्ट्रेटल मस्तिष्क स्लाइस के परिपत्र-छिद्रित टुकड़ों का उपयोग करती है। हम पीडी के माउस मॉडल के स्ट्रेटल स्लाइस में कम बेसल ओसीआर की पहचान करके इस तकनीक की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं। यह विधि पीडी और हंटिंगटन रोग के क्षेत्र में काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए व्यापक रुचि होगी।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग और अल्जाइमर रोग 1,2,3 सहित कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में फंसाया गया है। पीडी मॉडल जैसे पिंक 1 नॉकआउट (केओ) चूहों और चूहों ने बिगड़ा हुआ माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन 4,5,6,7,8,9,10,11 प्रदर्शित किया। माइटोकॉन्ड्रिया स्ट्रिएटम (एसटीआर) या वृद्ध पिंक 1 केओ माउस के पूरे मस्तिष्क से पृथक जटिल मैं 7,10,12,13 में दोष प्रदर्शित करता है। ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को सीधे मापना माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है क्योंकि ओसीआर एटीपी उत्पादन के साथ युग्मित है, माइटोकॉन्ड्रिया14 का प्रमुख कार्य। इसलिए, रोग मॉडल या रोगी-व्युत्पन्न नमूनों / ऊतक में ओसीआर को मापने से यह जांचने में मदद मिल सकती है कि माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता बीमारी की ओर कैसे ले जाती है।
वर्तमान में, माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर को मापने के कई तरीके हैं, जिनमें क्लार्क इलेक्ट्रोड और अन्य ओ2 इलेक्ट्रोड, ओ2 फ्लोरोसेंट डाई और बाह्य प्रवाह विश्लेषक 15,16,17,18,19 शामिल हैं। एक लाभ के रूप में, ओ2 इलेक्ट्रोड-आधारित विधियां विभिन्न सब्सट्रेट को आसानी से जोड़ने की अनुमति देती हैं। हालांकि, वे एक साथ कई नमूनों को मापने के लिए अपर्याप्त हैं। पारंपरिक ओ 2 इलेक्ट्रोड-आधारित तरीकों की तुलना में, बाह्यप्रवाह विश्लेषक, सेल संस्कृतियों या शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया में ओसीआर के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण, बेहतर थ्रूपुट 15,18,20 प्रदान करता है। फिर भी, इन सभी विधियों को आमतौर पर पृथक माइटोकॉन्ड्रिया या सेल संस्कृतियों 6,16,17,19,20,21 में ओसीआर को मापने के लिए लागू किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव अनजाने में क्षति का कारण बनता है, और निकाले गए माइटोकॉन्ड्रिया या सेल संस्कृतियां बरकरार मस्तिष्क स्लाइस22 की तुलना में शारीरिक रूप से कम प्रासंगिक हैं। यहां तक कि जब स्लाइस में माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है, तो वे सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में कम संवेदनशील और संचालित करने में अधिक कठिन होते हैं23.
इन चुनौतियों का सामना करने के लिए, हमने एक्सएफ 24 बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके एक विधि विकसित की, जो चूहों के तीव्र स्ट्रेटल मस्तिष्क स्लाइस से कई चयापचय मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति देताहै 24. यह तकनीक ओसीआर के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का निरंतर प्रत्यक्ष परिमाणीकरण प्रदान करती है। संक्षेप में, स्ट्राइटल मस्तिष्क स्लाइस के छोटे वर्गों को आइलेट प्लेट के कुओं में रखा जाता है, और विश्लेषक क्रमशः 17,21,25 ओसीआर और बाह्य अम्लीकरण दर को मापने के लिए ऑक्सीजन और प्रोटॉन फ्लोरोसेंट-आधारित बायोसेंसर का उपयोग करता है।
विश्लेषक की अनूठी विशेषताओं में से एक चार इंजेक्शन कुएं हैं, जो क्रमिक रूप से चार यौगिकों या अभिकर्मकों को इंजेक्ट करते समय ओसीआर के निरंतर माप की अनुमति देते हैं; यह बेसल माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर, एटीपी-लिंक्ड ओसीआर और अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर जैसे कई सेलुलर श्वसन मापदंडों के माप को सक्षम बनाता है। यहां दिखाए गए प्रोटोकॉल के लिए माप के दौरान इंजेक्ट किए गए यौगिक पहले समाधान में 10 एमएम पाइरूवेट अच्छी तरह से (पोर्ट ए), दूसरे समाधान में 20 μM ओलिगोमाइसिन अच्छी तरह से (पोर्ट बी), तीसरे कुएं (पोर्ट सी) में 10 μM कार्बोनिल साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी), और चौथे कुएं में 20 μM एंटीमाइसिन ए की सांद्रता काम कर रहे थे फ्राइड एट अल .25 के आधार पर। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये सांद्रता काम कर रहे थे, और 10x, 11x, 12x और 13x के स्टॉक समाधान क्रमशः डी के माध्यम से समाधान बंदरगाहों ए में इंजेक्ट किए गए थे। प्रत्येक समाधान का उपयोग करने का उद्देश्य निम्नानुसार था: 1) पाइरूवेट आवश्यक था, क्योंकि इसके बिना, एफसीसीपी के अलावा उपलब्ध सब्सट्रेट की सीमा के कारण ओसीआर प्रतिक्रिया में कमी आएगी; 2) ओलिगोमाइसिन एटीपी सिंथेज़ को रोकता है और एटीपी लिंक्ड श्वसन के माप की अनुमति देता है; 3) एफसीसीपी फॉस्फोराइलेशन से ऑक्सीकरण को अनकपल्स करता है और अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता के माप की अनुमति देता है; 4) एंटीमाइसिन ए इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में जटिल III को रोकता है और इसलिए, ओसीआर के माप को माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़ा नहीं होने की अनुमति देता है।
उपयोग किए गए ओलिगोमाइसिन की एकाग्रता निम्नलिखित कारणों के आधार पर निर्धारित की गई थी: 1) अधिकांश सेल प्रकारों (पृथक माइटोकॉन्ड्रिया या सेल संस्कृतियों) के लिए ओलिगोमाइसिन की अनुशंसित खुराक 1.5 μM है। अनुभव से, आमतौर पर पृथक कोशिकाओं की खुराक के 3x-10x टुकड़ा प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि एक ढाल हो सकता है, और स्लाइस में समाधान के प्रवेश में समय लगता है। इसलिए, एकाग्रता 5 μM से 25 μM की सीमा में होनी चाहिए। 2) फ्राइड एट अल.25 के आधार पर एक 20 μM एकाग्रता का चयन किया गया था। ओलिगोमाइसिन की गैर-विशिष्ट विषाक्तता के कारण उच्च सांद्रता की कोशिश नहीं की गई थी। 3) अंडरवुड एट अल .26 की रिपोर्ट में, लेखकों ने ओलिगोमाइसिन के लिए एक अनुमापन प्रयोग किया और पाया कि 6.25, 12.5, 25 और 50 μg / एमएल पर खुराक के परिणामस्वरूप समान निषेध हुआ। ओलिगोमाइसिन (50 μg / एमएल) की उच्च एकाग्रता अधिक बाधित नहीं हुई लेकिन एक बड़ा विचरण था। 4) हमारे अवलोकन में, निर्धारण कारक ओलिगोमाइसिन की मर्मज्ञ क्षमता प्रतीत होता है। ओलिगोमाइसिन के लिए ऊतक में प्रवेश करना मुश्किल है, और यही कारण है कि पठार तक पहुंचने में कम से कम 7 से 8 चक्र लगते हैं, अधिकतम प्रतिक्रिया। जब तक यह पठार तक पहुंचता है, तब तक निषेध को अधिकतम माना जाता है।
स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को मापने के लिए बाह्य प्रवाह विश्लेषक को अनुकूलित करने की एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती ऊतक हाइपोक्सिया को रोकना है। चूंकि माप की पूरी अवधि (लगभग 4 घंटे) के दौरान बफर ऑक्सीजन युक्त नहीं था, इसलिए हाइपोक्सिया एक केंद्रीय मुद्दा था। यह मोटे ऊतक के नमूनों के लिए विशेष रूप से सच है, जहां ऑक्सीजन पूरे नमूनों में फैल नहीं सकता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, स्लाइस को 150 μm मोटाई पर विभाजित किया गया था, ताकि परिवेश ऑक्सीजन मस्तिष्क स्लाइस के बीच में प्रवेश कर सके। एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को पूर्व-ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) बफर में जोड़ा गया था, जिसने अधिकतम ओसीआर के निर्धारण की सुविधा प्रदान की, जैसा कि पहले23 का सुझाव दिया गया था। हमने जांच की कि क्या कोशिकाएं जीवित थीं। सबसे पहले, होचस्ट 33258 (10 μM) और प्रोपिडियम आयोडाइड (10 μM) का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या इन स्थितियों के तहत कोशिकाएं स्वस्थ थीं। फिर हमने जांच की कि पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मध्यम स्पाइनी न्यूरॉन्स कार्यात्मक रूप से स्वस्थ थे या नहीं। हमने आगे मूल्यांकन किया कि स्ट्राइटल स्लाइस में डोपामाइन (डीए) टर्मिनल फास्ट-स्कैन वोल्टामेट्री का उपयोग करके डीए रिलीज को मापकर कार्यात्मक रूप से स्वस्थ थे या नहीं। परिणामों से पता चला कि स्ट्राइटल स्लाइस जो ऑक्सीजन युक्त नहीं थे (एसीएसएफ / बीएसए समूह) ऑक्सीजन युक्त नियंत्रण समूह24 के रूप में स्वस्थ थे।
फिर हमने प्रवाह श्वसन परख के लिए इष्टतम स्ट्रेटल स्लाइस स्थितियों को निर्धारित करने के लिए टुकड़ा मोटाई और पंच आकार के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण किया। विश्लेषक का उपयोग करके ओसीआर विश्लेषण के लिए विभिन्न मोटाई (150 μm और 200 μm) और पंच आकार (1.0 मिमी, 1.5 मिमी और व्यास में 2.0 मिमी) के साथ पृष्ठीय स्ट्राइटल स्लाइस का उपयोग किया गया था। स्ट्रेटल स्लाइस जो व्यास में 1.5 मिमी के पंच आकार के साथ 150 μm मोटे थे, विश्लेषक24 के लिए एक इष्टतम सीमा के भीतर उच्चतम युग्मन दक्षता और ओसीआर थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे द्वारा विकसित विधि ने एक्सएफ विश्लेषक को 4 घंटे की अवधि में वयस्क चूहों से स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को मापने के लिए उपयोग करने की अनुमति दी। यह विधि शारीरिक रूप से परिभाषित मस्तिष्क संरचनाओं से ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वांगचेन त्सेरिंग और पामेला वाल्टर को इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) (एनएस 054773 से सीजेएल और एनएस 0 9 83 9 3 से एचजेड) और थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय में तंत्रिका विज्ञान विभाग (एचजेड के लिए स्टार्टअप फंड) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Referências
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