Yetişkin Farelerden Akut Striatal Dilimlerde Oksijen Tüketim Hızının Ölçülmesi
Summary
Oksijen tüketim hızı (OCR), mitokondriyal fonksiyon için yaygın bir vekildir ve farklı hastalık modellerini incelemek için kullanılabilir. Yetişkin farelerden akut striatal dilimlerdeki OCR’yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdik ve bu da fizyolojik olarak diğer yöntemlerden daha alakalı.
Abstract
Mitokondri, hücresel ATP üretiminde, reaktif oksijen türlerinin düzenlenmesinde ve Ca2 + konsantrasyon kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır. Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalığın patogenezinde rol oynamıştır. Mitokondrinin bu hastalıkların modellerindeki rolünü incelemek için, mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak oksijen tüketim oranı (OCR) yoluyla mitokondriyal solunumu ölçebiliriz. OCR, hücre kültürlerinde ve izole mitokondrilerde zaten başarıyla ölçülmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler akut beyin dilimlerinde OCR’yi ölçmekten daha az fizyolojik olarak ilgilidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yazarlar yetişkin farelerden akut striatal dilimlerde OCR’yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdiler. Teknik, PD ve Huntington hastalığında yer alan bir beyin bölgesi olan striatuma odaklanarak optimize edilmiştir. Analizör, 24 numunenin eşzamanlı kinetik ölçümüne izin veren 24 delikli bir plaka kullanarak canlı bir hücre testi gerçekleştirir. Yöntem, örnek olarak dairesel delikli striatal beyin dilimleri parçalarını kullanır. Bu tekniğin etkinliğini, PD’nin bir fare modelinin striatal dilimlerinde daha düşük bir bazal OCR tanımlayarak gösteriyoruz. Bu yöntem, PD ve Huntington hastalığı alanında çalışan araştırmacılar için geniş ilgi çekici olacaktır.
Introduction
Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıklarda rol oynamıştır. PINK1 nakavt (KO) fareleri ve sıçanlar gibi PD modelleri, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon 4,5,6,7,8,9,10,11 gösterir. Yaşlı PINK1 KO farenin striatumundan (STR) veya tüm beyninden izole edilen mitokondri, kompleks I 7,10,12,13’te kusurlar sergiler. Oksijen tüketim oranının (OCR) doğrudan ölçülmesi, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için en yaygın yöntemlerden biridir, çünkü OCR, mitokondri14’ün temel işlevi olan ATP üretimi ile birleştirilir. Bu nedenle, OCR’nin hastalık modellerinde veya hasta kaynaklı örneklerde / dokularda ölçülmesi, mitokondriyal disfonksiyonun hastalığa nasıl yol açtığını araştırmaya yardımcı olabilir.
Şu anda, Clark elektrodu ve diğer O2 elektrotları,O2 floresan boya ve hücre dışı akı analizörü15,16,17,18,19 dahil olmak üzere mitokondriyal OCR’yi ölçmenin birkaç yolu vardır. Bir avantaj olarak,O2 elektrot bazlı yöntemler çeşitli substratların kolayca eklenmesini sağlar. Bununla birlikte, birkaç numuneyi aynı anda ölçmek için yetersizdirler. GelenekselO2 elektrot bazlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, hücre kültürlerinde OCR veya saflaştırılmış mitokondri için yaygın olarak kullanılan bir araç olan hücre dışı akı analizörü,gelişmiş verim 15,18,20 sunar. Bununla birlikte, tüm bu yöntemler genellikle izole mitokondri veya hücre kültürlerinde OCR’yi ölçmek için uygulanır 6,16,17,19,20,21. Mitokondrinin izolasyonu yanlışlıkla hasara neden olur ve ekstrakte edilen mitokondri veya hücre kültürleri, fizyolojik olarak sağlam beyin dilimlerinden daha az ilgilidir22. Mikroelektrotlar dilimlerde kullanıldığında bile, kültürlenmiş hücrelere göre daha az hassastır ve çalıştırılması daha zordur23.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, farelerin akut striatal beyin dilimlerinden çoklu metabolik parametrelerin analizine izin veren XF24 hücre dışı akı analizörünü kullanarak bir yöntem geliştirdik24. Bu teknik, OCR aracılığıyla mitokondriyal solunumun sürekli doğrudan nicelleştirilmesini sağlar. Kısacası, striatal beyin dilimlerinin küçük bölümleri adacık plakasının kuyucuklarına yerleştirilir ve analizör, OCR ve hücre dışı asitleşme oranını ölçmek için sırasıyla17,21,25 olan oksijen ve proton floresan bazlı biyosensörleri kullanır.
Analizörün benzersiz özelliklerinden biri, dört adede kadar bileşiği veya reaktifi sırayla enjekte ederken OCR’nin sürekli ölçümüne izin veren dört enjeksiyon kuyusudur; bu, bazal mitokondriyal OCR, ATP’ye bağlı OCR ve maksimum mitokondriyal OCR gibi çeşitli hücresel solunum parametrelerinin ölçülmesini sağlar. Burada gösterilen protokol ölçümleri sırasında enjekte edilen bileşikler, birinci çözelti kuyusunda (port A) 10 mM piruvat, ikinci çözelti kuyusunda (port B) 20 μM oligomisin, üçüncü kuyuda (port C) 10 μM karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) ve dördüncü kuyuda (port D) 20 μM antimisin A çalışma konsantrasyonlarıydı. Fried ve ark.25’e dayanmaktadır. Bu konsantrasyonların çalışma konsantrasyonları olduğu ve sırasıyla A’dan D’ye kadar olan çözelti portlarına 10x, 11x, 12x ve 13x’lik stok çözeltilerinin enjekte edildiği belirtilmelidir. Her bir çözeltinin kullanılmasının amacı aşağıdaki gibiydi: 1) Piruvat gerekliydi, çünkü onsuz, FCCP ilavesi, mevcut substratların sınırlandırılmasından kaynaklanan azalmış bir OCR tepkisine sahip olacaktı; 2) Oligomisin, ATP sentazı inhibe eder ve ATP’ye bağlı solunumun ölçülmesine izin verir; 3) FCCP, oksidasyonu fosforilasyondan ayırır ve maksimum mitokondriyal kapasitenin ölçülmesine izin verir; 4) Antimisin A, elektron taşıma zincirindeki kompleks III’ü inhibe eder ve bu nedenle mitokondriye bağlı olmayan OCR’nin ölçülmesine izin verir.
Kullanılan oligomisin konsantrasyonu aşağıdaki nedenlere dayanarak belirlenmiştir: 1) Çoğu hücre tipi (izole mitokondri veya hücre kültürleri) için önerilen oligomisin dozu 1.5 μM’dir. Deneyimlere göre, genellikle ayrışmış hücre dozunun 3x-10x’i dilim deneyleri için kullanılır, çünkü bir gradyan olabilir ve çözeltinin dilimlere nüfuz etmesi zaman alır. Bu nedenle, konsantrasyon 5 μM ila 25 μM aralığında olmalıdır. 2) Fried ve ark.25’e dayanarak 20 μM konsantrasyon seçildi. Oligomisinin spesifik olmayan toksisitesi nedeniyle daha yüksek konsantrasyonlar denenmemiştir. 3) Underwood ve ark.26 tarafından hazırlanan raporda, yazarlar oligomisin için bir titrasyon deneyi yaptılar ve 6.25, 12.5, 25 ve 50 μg / mL’deki dozların benzer inhibisyonla sonuçlandığını buldular. Daha yüksek oligomisin konsantrasyonu (50 μg / mL) daha fazla inhibe etmedi, ancak daha büyük bir varyansa sahipti. 4) Gözlemimizde, belirleyici faktör oligomisinin nüfuz etme kabiliyeti gibi görünmektedir. Oligomisinin dokuya nüfuz etmesi zordur ve bu nedenle maksimum yanıt olan platoya ulaşmak için en az 7 ila 8 döngü gerekir. Platoya ulaştığı sürece, inhibisyonun maksimum olduğu varsayılır.
Striatal dilimlerde OCR’yi ölçmek için hücre dışı akı analizörünü uyarlamanın önemli bir teknik zorluğu, doku hipoksisini önlemektir. Tampon, ölçümlerin tüm süresi boyunca (yaklaşık 4 saat) oksijenlenmediğinden, hipoksi merkezi bir konuydu. Bu, özellikle oksijenin numuneler boyunca yayılamadığı daha kalın doku örnekleri için geçerlidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, dilimler 150 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı, böylece ortam oksijeni beyin dilimlerinin ortasına nüfuz edebildi. Ek olarak, önceden oksijenlenmiş yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) tamponuna 4 mg / mL sığır serum albümini (BSA) eklenmiştir, bu da daha önce önerildiği gibi maksimum OCR’nin belirlenmesini kolaylaştırmıştır23. Hücrelerin canlı olup olmadığını inceledik. İlk olarak, hücrelerin bu koşullar altında sağlıklı olup olmadığını incelemek için Hoechst 33258 (10 μM) ve propidium iyodür (10 μM) kullanılmıştır. Daha sonra orta dikenli nöronların yama-kelepçe kaydı kullanarak işlevsel olarak sağlıklı olup olmadığını inceledik. Ayrıca, striatal dilimlerdeki dopamin (DA) terminallerinin, hızlı tarama voltametrisi kullanarak DA salınımını ölçerek fonksiyonel olarak sağlıklı olup olmadığını değerlendirdik. Sonuçlar, oksijenlenmemiş striatal dilimlerin (ACSF / BSA grubu) oksijenli kontrol grubu24 kadar sağlıklı olduğunu göstermiştir.
Daha sonra, akı solunum testi için en uygun striatal dilim koşullarını belirlemek için farklı dilim kalınlığı ve zımba boyutu kombinasyonlarını test ettik. Analizör kullanılarak OCR analizi için farklı kalınlıklarda (150 μm ve 200 μm) ve punch boyutlarında (1,0 mm, 1,5 mm ve 2,0 mm çapında) dorsal striatal dilimler kullanılmıştır. 1,5 mm çapında zımba boyutuna sahip 150 μm kalınlığındaki Striatal dilimler, analizör24 için en yüksek bağlantı verimliliğine ve OCR’lere sahipti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geliştirdiğimiz yöntem, yetişkin farelerden striatal dilimlerde OCR’yi 4 saatlik bir süre boyunca ölçmek için bir XF analizörünün kullanılmasına izin verdi. Bu yöntem, anatomik olarak tanımlanmış beyin yapılarından eksize edilen yumruklardaki hücresel biyoenerjetik ölçümleri ölçmek için yeni bir yol sağlar. Analiz edilen doku örnekleri oldukça küçük olduğundan, bir hastalıkta yer alan belirli beyin bölgelerinin metabolik parametreleri araştırılabilir. Ek olarak, akut dilimlerin kulla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wangchen Tsering ve Pamela Walter’a bu makaleyi eleştirel okumaları ve düzenledikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) (NS054773’ten C.J. L.’ye ve NS098393’ten H.Z.Z.’ye) ve Thomas Jefferson Üniversitesi Sinirbilim Bölümü (H.Z.’ye Başlangıç Fonları) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
Referências
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson’s disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson’s disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson’s disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
