インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化
Summary
ここでは、複数の濃度応答を同時に取得しながら細菌群動性を評価するためのインデューサーグラジエントプレートの使用について説明します。
Abstract
細菌群動性は、細菌群集が半固体表面上を移動するために使用する一般的な微生物学的表現型である。誘導された群動性の調査において、誘導物質の特定の濃度は、種から所望の応答を引き出すために最適濃度範囲内で起こる事象を報告することができない可能性がある。複数の濃度を含む半固体プレートは、インデューサー濃度範囲内の応答を調査するために一般的に使用される。しかし、別々の半固体プレートは、不均一な凝固時間のために各プレート内の中粘度および含水率の変動を増加させる。
この論文では、単一のグラジエントプレート上で表面群動性を同時に試験するワンステップ法について説明し、アイソメトリックに配置された試験ウェルは多濃度応答の同時取得を可能にする。本研究では、 大腸菌 K12および 緑膿菌 PAO1の表面群動を、レスベラトロールおよびアラビノースなどの誘導物質の濃度勾配に応答して評価した。定期的に、群れの形態を画像化システムを用いて画像化し、表面全体の群動過程を捉えた。
群れの形態の定量的測定は、ImageJソフトウェアを使用して取得され、群れ領域の分析可能な情報を提供しました。この論文は、表面群動に対するインデューサーの効果に関する定性的および定量的な情報を提供する単純な勾配スウォームプレート法を提示し、より広い範囲の運動性細菌種に対する他のインデューサーの効果を研究するために拡張することができる。
Introduction
細菌群動性は、物質の表面を横切る細菌細胞の集団的移動を指す。実験室で特別に準備された半固体寒天プレート1に加えて、この表現型は動物組織2、水和表面3、植物の根4などのいくつかの柔らかい基質にも観察されます。半固体表面は細菌群がる基本的な条件の1つと考えられていますが、いくつかの種はまた、それらの群動性をサポートするためにエネルギーに富んだ培地を必要とします5。鞭毛の回転は、水泳と群がる運動性の両方を動かします – 水泳は、液体環境内の単細胞運動性を表しますが、群れは半固体表面を横切る微生物集団の同期運動です。
基質粘度は細菌の運動性に影響を及ぼす。 ヘリコバクター・ピロリなどの病原性微生物の研究では、病原体の運動性はムチン層の粘度によって変化し、ヒト宿主の環境酸性化の影響を受けることが示されています6。これらの環境を再現するために、0.3%(w / v)を超える寒天濃度を使用した以前の研究では、細菌の遊泳運動性が制限され、表面群動への漸進的なシフトがもたらされた。1%(w / v)を超える寒天濃度の使用は、多くの種の群れ運動性を防ぎます7。表面に形成されるコロニーパターンは、特徴のないmat8、雄牛の目9、樹状突起10、渦11など、多様です。
このようなパターンの関連性は不明のままですが、これらのパターンは環境的および化学的手がかりに依存しているようです12。環境の手がかりは、温度、塩分濃度、光、pHなどのさまざまな側面をカバーしていますが、化学的手がかりには、微生物クォーラムセンシング分子、生化学的副産物、栄養素の存在が含まれます。AHL(N-ヘキサノイル-Lホモセリンラクトン)などの自己誘導物質クォーラムセンシングシグナル伝達分子は、界面活性剤の産生を調節することによって表面群動に影響を与えることができる13,14。フィトアレキシン化合物であるレスベラトロールは、細菌の群れ運動性を制限する可能性があります15。
本研究では、野生型大腸菌K12株に対するレスベラトロールの勾配濃度の影響を調査し、操作された大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeH種のアラビノース誘導性群動性を調べる。YdeH酵素の産生はaraBADプロモーターを介してアラビノースによって誘導され、細胞のc-di-GMP摂動をもたらし、細菌群動性に影響を与える16,17。この誘導性群動は、大腸菌K12-YdeHおよび緑膿菌PAO1-YdeH株を用いたアラビノース勾配群プレートを用いて研究される。
この勾配温板は、二層媒体を順次固化させることにより調製される(図1B)。最下層は、インデューサーと共に添加された培地を含み、支柱状のペトリ皿の片面に注がれる。最下層の固化に際し、シャーレは平坦な表面に戻り、そこでインデューサを含まない媒体を含む上層がプレートの反対側から添加される。スウォームプレートが完全に固化した後、固定レイアウトに従ってウォームプレートに穴を開けることによって(図1C)、または媒体硬化プロセス中にペグを含むプレートカバーの3Dプリントモデルを使用してウェルをインプリントすることによって(補足図S1)、等尺的に配列された保持ウェルが生成される。ゲルイメージングシステムは、異なる時点での群れ形態をキャプチャするために使用されます(図2)。ImageJソフトウェアを使用した表面スウォーミングの解析(補足図S2)は、表面スウォーミングプロセスの定量的結果を提供します(図3)。
したがって、我々は、誘導物質の濃度範囲内で表面群動運動性を試験する簡単な方法を提案する。この方法は、誘導物質を最下層培地に混合することによって他の誘導物質の複数の濃度応答を試験するために使用することができ、他の運動性種(例えば、 枯草菌、 サルモネラ・エンテリカ、 プロテウス・ミラビリス、 エルシニア・エンテロコリチカ)に適用することができる。このアプローチは、単一の化学誘導物質をスクリーニングするための信頼できる定性的および定量的結果を提供することができ、より多くの化学誘導物質を評価するために別々のプレートを使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
半固体グラジエントプレート上の細菌群動性の調査は、基質粘度、湿度、培地成分などの複数の要因を含むため、困難な作業になる可能性があります18,19,20。これらの要因の中で、寒天濃度は、水泳または群がる運動性のいずれかへの微生物の復帰を決定する上で決定的な役割を果たす。寒天濃度が0.3%(w/v)から1%(w/v)に増加…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この技術の開発は、科学技術部の国家重点研究開発計画(2018YF0902604)、中国国家自然科学財団の国際若手科学者研究基金(22050410270)、深セン先端技術研究所外部資金(DWKF20190001)の資金によって支援されました。陳新義嬢が文書の校正と研究室管理にご協力いただいたことに心から感謝申し上げます。
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
