Kvantifiering av bakteriell yta som svärmar motilitet på inducerargradientplattor
Summary
Här beskriver vi användningen av inducerargradientplattor för att utvärdera bakteriell svärmande rörlighet samtidigt som man erhåller flera koncentrationssvar.
Abstract
Bakteriell svärmande rörlighet är en vanlig mikrobiologisk fenotyp som bakteriesamhällen använder för att migrera över halvfatta ytor. Vid undersökningar av inducerad svärmande motilitet kan det vara möjligt att specifik koncentration av en inducerare inte kan rapportera händelser som inträffar inom det optimala koncentrationsområdet för att framkalla de önskade svaren från en art. Halvfacitplattor innehållande flera koncentrationer används vanligen för att undersöka responsen inom ett inducerarkoncentrationsområde. Separata halvfasta plattor ökar emellertid variationerna i medelviskositet och fuktinnehåll inom varje platta på grund av ojämn stelningstid.
Detta dokument beskriver en enstegsmetod för att samtidigt testa ytans svärmande rörlighet på en enda gradientplatta, där de isometriskt anordnade testbrunnarna möjliggör samtidig förvärv av multikoncentrationssvar. I det aktuella arbetet utvärderades ytsvärmningen av Escherichia coli K12 och Pseudomonas aeruginosa PAO1 som svar på en koncentrationsgradient av inducerare såsom resveratrol och arabinos. Periodiskt avbildades svärmmorfologierna med hjälp av ett bildsystem för att fånga hela ytsvärmningsprocessen.
Den kvantitativa mätningen av svärmmorfologierna förvärvades med hjälp av ImageJ-programvaran, vilket gav analyserbar information om svärmområdet. Denna uppsats presenterar en enkel gradient swarm plate metod som ger kvalitativ och kvantitativ information om inducerarnas effekter på ytsvärmning, som kan utvidgas för att studera effekterna av andra inducerare på ett bredare spektrum av rörliga bakteriearter.
Introduction
Bakteriell svärmande motilitet avser den kollektiva migrationen av bakterieceller över ytan av ett ämne. Förutom halvfafa agarplattor speciellt framställda i laboratoriet1 observeras denna fenotyp också på vissa mjuka substrat såsom djurvävnader2, hydratiserade ytor3 och växtrötter4. Medan en halvfast yta anses vara en av de grundläggande förutsättningarna för bakteriell svärmning, kräver vissa arter också ett energirikt medium för att stödja deras svärmande rörlighet5. Flagellarotationskrafter både simning och svärmande motilitetssimning beskriver den encelliga rörligheten i en flytande miljö, medan svärmning är den synkrona rörelsen hos en mikrobiell population över halvfatta ytor.
Substratviskositet påverkar bakteriell motilitet; Studier av patogena mikrober, såsom Helicobacter pylori, har visat att patogenens rörlighet förändras beroende på mucinskiktets viskositet, vilket påverkas av miljöförsurning i den mänskliga värden6. För att replikera dessa miljöer begränsar tidigare studier med agarkoncentration över 0,3% (w / v) bakteriell simningsmotilitet för att åstadkomma en gradvis övergång till ytsvärmning. Användningen av agarkoncentration över 1 % (w/v) förhindrar svärmande rörlighet hos många arter7. Kolonimönstren som bildas på ytan är olika, inklusive funktionslös matta8, tjuröga9, dendriter10 och virvel11.
Även om relevansen av sådana mönster fortfarande är oklar verkar dessa mönster vara beroende av miljömässiga och kemiska signaler12. Miljösignaler täcker olika aspekter, inklusive temperatur, salthalt, ljus och pH, medan kemiska signaler inkluderar närvaron av mikrobiella kvorumavkänningsmolekyler, biokemiska biprodukter och näringsämnen. Autoinducerares kvorumavkännande signalmolekyler såsom AHL (N-hexanoyl-L homoserinlakton) kan påverka ytsvärmningen genom att reglera produktionen av ytaktivt medel13,14. Resveratrol, en fytoalexinförening, kan begränsa bakteriell svärmande rörlighet15.
I det aktuella arbetet undersöker vi effekten av gradientkoncentrationer av resveratrol på vildtyp Escherichia coli K12-stam och undersöker arabinosinducerbar svärmande motilitet hos konstruerade E. coli K12-YdeH och Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-arter. Produktionen av YdeH-enzymet induceras av arabinos via araBAD-promotorn, vilket resulterar i cellulär c-di-GMP-störning och påverkar bakteriell svärmande motilitet16,17. Detta inducerbara svärmningsbeteende studeras med användning av arabinosgradientsvärmplattor med E. coli K12-YdeH och P. aeruginosa PAO1-YdeH-stammar.
Gradientsvärmplattorna framställs genom successivt stelnande dubbelskiktsmedium (figur 1B). Bottenskiktet består av mediet tillsatt med induceraren, hälld på ena sidan av en uppspänd petriskål. Vid stelningen av bottenskiktet återförs petriskålen till en plan yta, där det övre skiktet innehållande mediet utan induceraren tillsätts från andra sidan plattan. Efter att svärmplattorna har stelnat helt produceras isometriskt anordnade hållbrunnar genom uppborrningshål på svärmplattorna efter en fast layout (figur 1C) eller genom att brunnarna präglas med hjälp av en 3D-printad modell av plattkåpan som innehåller pinnar under medelhärdningsprocessen (tilläggsfigur S1). Ett gelarvbildningssystem används för att fånga de svärmande morfologierna vid olika tidpunkter (figur 2). Analys av ytsvärmning med hjälp av ImageJ-programvara (kompletterande figur S2) ger kvantitativa resultat av ytsvärmningsprocessen (figur 3).
Således föreslår vi en enkel metod för att testa ytsvärmande rörlighet inom ett koncentrationsområde av inducerare. Denna metod kan användas för att testa flera koncentrationssvar från andra inducerare genom att blanda induceraren i bottenskiktets medium och kan appliceras på andra rörliga arter (t.ex. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Detta tillvägagångssätt kan ge tillförlitliga kvalitativa och kvantitativa resultat för screening av en enda kemisk inducerare, och separata plattor kan användas för att utvärdera fler kemiska inducerare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersökning av bakteriell svärmande rörlighet på halvfatta gradientplattor kan vara en utmanande uppgift18,19,20, eftersom det involverar flera faktorer såsom substratviskositet, fuktighet och medelstora komponenter. Bland dessa faktorer spelar agarkoncentrationen en avgörande roll för att bestämma mikrobiell återgång till antingen simning eller svärmande rörlighet. När agarkoncentrationen ökar från 0,3 % (w/v) t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utvecklingen av denna teknik stöddes av medel från ministeriet för vetenskap och tekniks nationella nyckelforskningsplan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China’s Research Fund for International Young Scientists (22050410270) och Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vill framföra vår uppriktiga tacksamhet till fröken Chen Xinyi för hennes hjälp med korrekturläsning av dokumentet och laboratoriehanteringen.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
