İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi
Summary
Burada, aynı anda çoklu konsantrasyon tepkileri elde ederken bakteriyel kaynama hareketliliğini değerlendirmek için indükleyici gradyan plakalarının kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Bakteriyel sürü hareketliliği, bakteri topluluklarının yarı katı yüzeyler üzerinde göç etmek için kullandıkları yaygın bir mikrobiyolojik fenotiptir. İndüklenmiş sürü hareketliliğinin araştırılmasında, bir indükleyicinin spesifik konsantrasyonu, bir türden istenen yanıtları ortaya çıkarmak için optimal konsantrasyon aralığında meydana gelen olayları rapor edemeyebilir. Birden fazla konsantrasyon içeren yarı katı plakalar, bir indükleyici konsantrasyon aralığındaki yanıtı araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, ayrı yarı katı plakalar, düzgün olmayan katılaşma süresi nedeniyle her plakadaki orta viskozite ve nem içeriğindeki değişimleri arttırır.
Bu yazıda, izometrik olarak düzenlenmiş test kuyularının çok konsantrasyonlu yanıtların eşzamanlı olarak elde edilmesine izin verdiği tek bir gradyan plaka üzerinde yüzey kaynatma hareketliliğini aynı anda test etmek için tek adımlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada, Escherichia coli K12 ve Pseudomonas aeruginosa PAO1’in yüzey sürüsü, resveratrol ve arabinoz gibi indükleyicilerin konsantrasyon gradyanına yanıt olarak değerlendirilmiştir. Periyodik olarak, sürü morfolojileri, tüm yüzey kaynama sürecini yakalamak için bir görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülendi.
Sürü morfolojilerinin kantitatif ölçümü, sürü alanının analiz edilebilir bilgilerini sağlayan ImageJ yazılımı kullanılarak elde edildi. Bu yazıda, indükleyicilerin yüzey kaynaması üzerindeki etkileri hakkında kalitatif ve nicel bilgi sağlayan basit bir gradyan sürü plakası yöntemi sunulmaktadır; bu, diğer indükleyicilerin daha geniş bir hareketli bakteri türü yelpazesi üzerindeki etkilerini incelemek için genişletilebilir.
Introduction
Bakteriyel kaynama hareketliliği, bakteri hücrelerinin bir maddenin yüzeyi boyunca toplu göçünü ifade eder. Laboratuvarda özel olarak hazırlanan yarı katı agar plakalarına1 ek olarak, bu fenotip, hayvan dokuları2, hidratlanmış yüzeyler3 ve bitki kökleri4 gibi bazı yumuşak substratlarda da gözlenir. Yarı katı bir yüzey, bakteri kaynaşmasının temel koşullarından biri olarak kabul edilirken, bazı türler de sürü hareketliliklerini desteklemek için enerji açısından zengin bir ortama ihtiyaç duyarlar5. Flagella rotasyonu hem yüzmeye hem de kaynama hareketliliğine güç verir-yüzme, sıvı bir ortamdaki tek hücreli hareketliliği tanımlarken, kaynama, mikrobiyal bir popülasyonun yarı katı yüzeyler boyunca senkronize hareketidir.
Substrat viskozitesi bakteriyel motiliteyi etkiler; Helicobacter pylori gibi patojenik mikroplar üzerinde yapılan çalışmalar, patojenin hareketliliğinin, insan konakçısındaki çevresel asitleşmeden etkilenen müsin tabakası viskozitesine bağlı olarak değiştiğini göstermiştir6. Bu ortamları çoğaltmak için,% 0.3’ün (w / v) üzerindeki agar konsantrasyonunu kullanan daha önceki çalışmalar, yüzey kaynamasına kademeli bir kaymayı etkilemek için bakteriyel yüzme hareketliliğini kısıtlamaktadır. Agar konsantrasyonunun %1’in (w/v) üzerinde kullanılması, birçok türün kaynama hareketliliğini önler7. Yüzeyde oluşan koloni desenleri, özelliksiz mat8, boğa gözü9, dendritler10 ve vorteks11 dahil olmak üzere çeşitlidir.
Bu tür kalıpların alaka düzeyi belirsizliğini korusa da, bu kalıplar çevresel ve kimyasal ipuçlarına bağlı gibi görünmektedir12. Çevresel ipuçları, sıcaklık, tuzluluk, ışık ve pH dahil olmak üzere farklı yönleri kapsarken, kimyasal ipuçları mikrobiyal çekirdek algılama moleküllerinin, biyokimyasal yan ürünlerin ve besin maddelerinin varlığını içerir. AHL (N-hekzanoil-L homoserin lakton) gibi otoindükleyici çekirdek algılama sinyal molekülleri, yüzey aktif madde üretimini düzenleyerek yüzey kaynamasını etkileyebilir13,14. Bir fitoaleksin bileşiği olan Resveratrol, bakteriyel sürü hareketliliğini kısıtlayabilir15.
Bu çalışmada, resveratrolün gradyan konsantrasyonlarının vahşi tip Escherichia coli K12 suşu üzerindeki etkisini araştırıyoruz ve mühendislik ürünü E. coli K12-YdeH ve Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH türlerinin arabinoz ile indüklenebilir sürü hareketliliğini araştırıyoruz. YdeH enziminin üretimi, arabinoz tarafından araBAD promotörü aracılığıyla indüklenir, bu da hücresel c-di-GMP pertürbasyonuna neden olur ve bakteriyel sürü hareketliliğini etkiler16,17. Bu indüklenebilir sürü davranışı, E. coli K12-YdeH ve P. aeruginosa PAO1-YdeH suşları ile arabinoz gradyan sürü plakaları kullanılarak incelenmiştir.
Gradyan sürü plakaları, çift katmanlı ortamın art arda katılaşmasıyla hazırlanır (Şekil 1B). Alt tabaka, desteklenmiş bir Petri kabının bir tarafına dökülen indükleyici ile eklenen ortamı içerir. Alt tabakanın katılaşması üzerine, Petri kabı düz bir yüzeye geri döndürülür, burada indükleyici olmadan ortamı içeren üst tabaka plakanın diğer tarafından eklenir. Sürü plakaları tamamen katılaştıktan sonra, izometrik olarak düzenlenmiş tutma kuyuları, sabit bir düzen izlenerek sürü plakaları üzerindeki deliklerin delinmesiyle (Şekil 1C) veya orta kürleme işlemi sırasında mandallar içeren plaka kapağının 3D baskılı bir modeli kullanılarak kuyucukların basılmasıyla üretilir (Ek Şekil S1). Farklı zaman noktalarındaki sürü morfolojilerini yakalamak için bir jel görüntüleme sistemi kullanılır (Şekil 2). ImageJ yazılımı kullanılarak yüzey kaynamasının analizi (Ek Şekil S2), yüzey kaynatma işleminin nicel sonuçlarını sağlar (Şekil 3).
Bu nedenle, bir indükleyici konsantrasyon aralığında yüzey kaynama hareketliliğini test etmek için basit bir yöntem öneriyoruz. Bu yöntem, indükleyiciyi alt tabaka ortamına karıştırarak diğer indükleyicilerin çoklu konsantrasyon tepkilerini test etmek için kullanılabilir ve diğer hareketli türlere (örneğin, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica) uygulanabilir. Bu yaklaşım, tek bir kimyasal indükleyicinin taranması için güvenilir kalitatif ve kantitatif sonuçlar sağlayabilir ve daha fazla kimyasal indükleyiciyi değerlendirmek için ayrı plakalar kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yarı katı gradyan plakalar üzerindeki bakteri kaynaşma hareketliliğinin araştırılması, substrat viskozitesi, nem ve orta bileşenler gibi birden fazla faktörü içerdiğinden zorlu bir görev olabilir18,19,20. Bu faktörler arasında, agar konsantrasyonu, yüzme veya sürü hareketliliğine mikrobiyal geri dönüşün belirlenmesinde belirleyici bir rol oynar. Agar konsantrasyonu %0,3’ten (w/v) %1’e (w/v) yükseldikç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu tekniğin geliştirilmesi, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’nın Ulusal Anahtar Ar-Ge planı (2018YF0902604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın Uluslararası Genç Bilim İnsanları Araştırma Fonu (22050410270) ve Shenzhen İleri Teknoloji Dış Fonları Enstitüleri (DWKF20190001) fonlarıyla desteklenmiştir. Bayan Chen Xinyi’ye, belgenin düzeltilmesinde ve laboratuvar yönetiminde yardımcı olduğu için içten şükranlarımızı sunmak istiyoruz.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
