Kvantificering af bakteriel overflade sværmende bevægelighed på induktorgradientplader
Summary
Her beskriver vi brugen af inducergradientplader til at evaluere bakteriel sværmningsmotilitet og samtidig opnå flere koncentrationsresponser.
Abstract
Bakteriel sværmende bevægelighed er en almindelig mikrobiologisk fænotype, som bakteriesamfund bruger til at migrere over halvfaste overflader. I undersøgelser af induceret sværmende bevægelighed kan en specifik koncentration af en inducer muligvis ikke rapportere hændelser, der forekommer inden for det optimale koncentrationsområde for at fremkalde de ønskede reaktioner fra en art. Halvfaste plader indeholdende flere koncentrationer anvendes almindeligvis til at undersøge responsen inden for et inducerkoncentrationsområde. Imidlertid øger separate halvfaste plader variationer i medium viskositet og fugtindhold i hver plade på grund af uensartet størkningstid.
Dette papir beskriver en et-trins metode til samtidig at teste overfladesværmende bevægelighed på en enkelt gradientplade, hvor de isometrisk arrangerede testbrønde muliggør samtidig erhvervelse af multikoncentrationsresponser. I det foreliggende arbejde blev overfladesværmen af Escherichia coli K12 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 evalueret som reaktion på en koncentrationsgradient af induktorer såsom resveratrol og arabinose. Med jævne mellemrum blev sværmmorfologierne afbildet ved hjælp af et billeddannelsessystem til at fange hele overfladesværmningsprocessen.
Den kvantitative måling af sværmmorfologierne blev erhvervet ved hjælp af ImageJ-software, der gav analyserbar information om sværmområdet. Dette papir præsenterer en simpel gradient sværmplademetode, der giver kvalitativ og kvantitativ information om induktorernes virkninger på overfladesværmning, som kan udvides til at studere virkningerne af andre induktorer på en bredere vifte af bevægelige bakteriearter.
Introduction
Bakteriel sværmende bevægelighed refererer til den kollektive migration af bakterieceller over overfladen af et stof. Ud over halvfaste agarplader, der er specielt fremstillet i laboratoriet1, observeres denne fænotype også på nogle bløde substrater såsom animalsk væv2, hydrerede overflader3 og planterødder4. Mens en halvfast overflade betragtes som en af de grundlæggende betingelser for bakteriesværmning, kræver nogle arter også et energirigt medium for at understøtte deres sværmende bevægelighed5. Flagella rotationskræfter både svømning og sværmende motilitetssvømning beskriver den encellede bevægelighed i et flydende miljø, mens sværmning er den synkrone bevægelse af en mikrobiel population på tværs af halvfaste overflader.
Substratviskositet påvirker bakteriel bevægelighed; undersøgelser af patogene mikrober, såsom Helicobacter pylori, har vist, at patogenets bevægelighed ændres afhængigt af mucinlagets viskositet, som påvirkes af miljøforsuring i den menneskelige vært6. For at replikere disse miljøer begrænser tidligere undersøgelser ved hjælp af agarkoncentration over 0,3% (w / v) bakteriel svømmemotilitet for at gennemføre et gradvist skift til overfladesværmning. Anvendelsen af agarkoncentration over 1 % (w/v) forhindrer sværmende bevægelighed hos mange arter7. Kolonimønstrene dannet på overfladen er forskellige, herunder funktionsløs mat8, bull’s eye9, dendritter10 og hvirvel11.
Selv om relevansen af sådanne mønstre fortsat er uklar, synes disse mønstre at være afhængige af miljømæssige og kemiske signaler12. Miljømæssige signaler dækker forskellige aspekter, herunder temperatur, saltholdighed, lys og pH, mens kemiske signaler omfatter tilstedeværelsen af mikrobielle quorum sensing molekyler, biokemiske biprodukter og næringsstoffer. Autoinducer quorum sensing signalmolekyler såsom AHL (N-hexanoyl-L homoserin lacton) kan påvirke overflade sværmning ved at regulere produktionen af overfladeaktivt stof13,14. Resveratrol, en phytoalexinforbindelse, kan begrænse bakteriel sværmende bevægelighed15.
I det foreliggende arbejde undersøger vi effekten af gradientkoncentrationer af resveratrol på vildtype Escherichia coli K12 stamme og undersøger arabinose-inducerbar sværmende bevægelighed af konstruerede E. coli K12-YdeH og Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH arter. Produktionen af YdeH-enzymet induceres af arabinose via araBAD-promotoren, hvilket resulterer i cellulær c-di-GMP-forstyrrelse og påvirker bakteriesværmningsmotiliteten16,17. Denne inducerbare sværmningsadfærd studeres ved hjælp af arabinose gradient sværmplader med E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer.
Gradientsværmpladerne fremstilles ved successivt størkning af dobbeltlagsmedium (figur 1B). Bundlaget består af mediet tilsat med induktoren, hældt på den ene side af en proppet petriskål. Ved størkning af bundlaget returneres petriskålen til en plan overflade, hvor det øverste lag, der indeholder mediet uden induktoren, tilsættes fra den anden side af pladen. Efter at sværmpladerne er fuldstændig størknet, produceres isometrisk arrangerede holdebrønde ved boring af huller på sværmpladerne efter et fast layout (figur 1C) eller ved at præge brøndene ved hjælp af en 3D-trykt model af pladedækslet, der indeholder pinde under mediumhærdningsprocessen (supplerende figur S1). Et gelbilleddannelsessystem bruges til at fange de sværmende morfologier på forskellige tidspunkter (figur 2). Analyse af overfladesværmning ved hjælp af ImageJ-software (supplerende figur S2) giver kvantitative resultater af overfladesværmningsprocessen (figur 3).
Således foreslår vi en simpel metode til at teste overfladesværmende bevægelighed inden for et koncentrationsområde af induktorer. Denne metode kan bruges til at teste flere koncentrationsresponser fra andre induktorer ved at blande induktoren i bundlagsmediet og kan anvendes på andre bevægelige arter (f.eks . Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Denne tilgang kan give pålidelige kvalitative og kvantitative resultater til screening af en enkelt kemisk induktor, og der kan anvendes separate plader til at evaluere flere kemiske induktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøgelse af bakteriel sværmende bevægelighed på halvfaste gradientplader kan være en udfordrende opgave18,19,20, da den involverer flere faktorer såsom substratviskositet, fugtighed og mellemstore komponenter. Blandt disse faktorer spiller agarkoncentration en afgørende rolle i bestemmelsen af mikrobiel tilbagevenden til enten svømning eller sværmende bevægelighed. Da agarkoncentrationen stiger fra 0,3 % (w/v) til …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udviklingen af denne teknik blev støttet af midlerne fra Ministeriet for Videnskab og Teknologis National Key R&D-plan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China’s Research Fund for International Young Scientists (22050410270) og Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vil gerne tilbyde vores oprigtige taknemmelighed til frøken Chen Xinyi for hendes hjælp til korrekturlæsning af dokumentet og laboratorieledelsen.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
