Quantification de la motilité de l’essaimage de surface bactérienne sur les plaques de gradient inducteur
Summary
Ici, nous décrivons l’utilisation de plaques de gradient inducteur pour évaluer la motilité de l’essaimage bactérien tout en obtenant simultanément plusieurs réponses de concentration.
Abstract
La motilité d’essaimage bactérien est un phénotype microbiologique commun que les communautés bactériennes utilisent pour migrer sur les surfaces semi-solides. Dans les études de la motilité d’essaimage induite, la concentration spécifique d’un inducteur peut ne pas être en mesure de signaler des événements se produisant dans la plage de concentration optimale pour obtenir les réponses souhaitées d’une espèce. Les plaques semi-solides contenant plusieurs concentrations sont couramment utilisées pour étudier la réponse dans une plage de concentration d’inducteur. Cependant, les plaques semi-solides séparées augmentent les variations de viscosité moyenne et de teneur en humidité à l’intérieur de chaque plaque en raison du temps de solidification non uniforme.
Cet article décrit une méthode en une étape pour tester simultanément la motilité de l’essaimage de surface sur une seule plaque de gradient, où les puits d’essai disposés isométriquement permettent l’acquisition simultanée de réponses multiconcentrations. Dans les présents travaux, l’essaimage de surface d’Escherichia coli K12 et de Pseudomonas aeruginosa PAO1 a été évalué en réponse à un gradient de concentration d’inducteurs tels que le resvératrol et l’arabinose. Périodiquement, les morphologies de l’essaim ont été imagées à l’aide d’un système d’imagerie pour capturer l’ensemble du processus d’essaimage de surface.
La mesure quantitative des morphologies de l’essaim a été acquise à l’aide du logiciel ImageJ, fournissant des informations analysables sur la zone de l’essaim. Cet article présente une méthode simple de plaque d’essaim à gradient qui fournit des informations qualitatives et quantitatives sur les effets des inducteurs sur l’essaimage de surface, qui peut être étendue pour étudier les effets d’autres inducteurs sur un plus large éventail d’espèces bactériennes mobiles.
Introduction
La motilité d’essaimage bactérien fait référence à la migration collective de cellules bactériennes à travers la surface d’une substance. Outre les plaques de gélose semi-solides spécialement préparées en laboratoire1, ce phénotype est également observé sur certains substrats mous tels que les tissus animaux2, les surfaces hydratées3 et les racines végétales4. Alors qu’une surface semi-solide est considérée comme l’une des conditions fondamentales de l’essaimage bactérien, certaines espèces ont également besoin d’un milieu riche en énergie pour soutenir leur motilité d’essaimage5. La rotation des flagelles alimente à la fois la nage et l’essaimage, la nage de motilité décrit la motilité unicellulaire dans un environnement liquide, tandis que l’essaimage est le mouvement synchrone d’une population microbienne sur des surfaces semi-solides.
La viscosité du substrat influence la motilité bactérienne; des études sur des microbes pathogènes, tels que Helicobacter pylori, ont montré que la motilité de l’agent pathogène change en fonction de la viscosité de la couche de mucine, qui est influencée par l’acidification environnementale chez l’hôte humain6. Pour reproduire ces environnements, des études antérieures utilisant une concentration de gélose supérieure à 0,3% (p / v) limitent la motilité de nage bactérienne pour effectuer un déplacement progressif vers l’essaimage de surface. L’utilisation d’une concentration de gélose supérieure à 1 % (p/v) empêche la motilité d’essaimage de nombreuses espèces7. Les motifs de colonie formés à la surface sont divers, y compris mat8 sans caractéristiques, œil de taureau9, dendrites10 et vortex11.
Bien que la pertinence de ces modèles reste incertaine, ces modèles semblent dépendre d’indices environnementaux et chimiques12. Les indices environnementaux couvrent différents aspects, y compris la température, la salinité, la lumière et le pH, tandis que les indices chimiques comprennent la présence de molécules microbiennes de détection du quorum, de sous-produits biochimiques et de nutriments. Les molécules de signalisation de détection de quorum auto-inducteurs telles que l’AHL (N-hexanoyl-L homosérine lactone) peuvent avoir un impact sur l’essaimage de surface en régulant la production de tensioactif13,14. Le resvératrol, un composé phytoalexine, pourrait limiter la motilité de l’essaimage bactérien15.
Dans le présent travail, nous étudions l’effet des concentrations de gradient de resvératrol sur la souche Escherichia coli K12 de type sauvage et étudions la motilité d’essaimage inductible à l’arabinose des espèces E. coli K12-YdeH et Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La production de l’enzyme YdeH est induite par l’arabinose via le promoteur araBAD, ce qui entraîne une perturbation cellulaire c-di-GMP et affecte la motilité de l’essaimage bactérien16,17. Ce comportement d’essaimage inductible est étudié à l’aide de plaques d’essaim à gradient arabinose avec des souches E. coli K12-YdeH et P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Les plaques d’essaim gradient sont préparées en solidifiant successivement un milieu à double couche (Figure 1B). La couche inférieure comprend le milieu ajouté avec l’inducteur, versé sur un côté d’une boîte de Petri soutenue. Lors de la solidification de la couche inférieure, la boîte de Petri est renvoyée sur une surface plane, où la couche supérieure contenant le milieu sans inducteur est ajoutée de l’autre côté de la plaque. Une fois les plaques d’essaim complètement solidifiées, des puits de rétention disposés isométriquement sont produits en forant des trous sur les plaques d’essaim suivant une disposition fixe (figure 1C) ou en imprimant les puits à l’aide d’un modèle imprimé en 3D du couvercle de la plaque contenant des chevilles pendant le processus de durcissement du milieu (figure supplémentaire S1). Un système d’imagerie sur gel est utilisé pour capturer les morphologies d’essaimage à différents moments (Figure 2). L’analyse de l’essaimage de surface à l’aide du logiciel ImageJ (figure supplémentaire S2) fournit des résultats quantitatifs du processus d’essaimage de surface (figure 3).
Ainsi, nous proposons une méthode simple pour tester la motilité de l’essaimage de surface dans une plage de concentration d’inducteurs. Cette méthode peut être utilisée pour tester les réponses de concentration multiples d’autres inducteurs en mélangeant l’inducteur dans le milieu de la couche inférieure et peut être appliquée à d’autres espèces mobiles (par exemple, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Cette approche pourrait fournir des résultats qualitatifs et quantitatifs fiables pour le criblage d’un seul inducteur chimique, et des plaques séparées pourraient être utilisées pour évaluer davantage d’inducteurs chimiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude de la motilité de l’essaimage bactérien sur les plaques de gradient semi-solides peut être une tâche difficile18,19,20, car elle implique de multiples facteurs tels que la viscosité du substrat, l’humidité et les composants du milieu. Parmi ces facteurs, la concentration de gélose joue un rôle décisif dans la détermination de la réversion microbienne vers la motilité de nage ou d’essaimage. Au fur et…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le développement de cette technique a été soutenu par les fonds du plan national de R&D clé du ministère de la Science et de la Technologie (2018YF0902604), du Fonds de recherche de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour les jeunes scientifiques internationaux (22050410270) et des fonds externes des Instituts de technologie avancée de Shenzhen (DWKF20190001). Nous tenons à exprimer notre sincère gratitude à Mlle Chen Xinyi pour son aide dans la relecture du document et la gestion du laboratoire.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
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