Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten
Summary
Hier beschreiben wir die Verwendung von Induktorgradientenplatten, um die Motilität des bakteriellen Schwarms zu bewerten und gleichzeitig mehrere Konzentrationsreaktionen zu erhalten.
Abstract
Die bakterielle Schwarmmotilität ist ein häufiger mikrobiologischer Phänotyp, den Bakteriengemeinschaften verwenden, um über halbfeste Oberflächen zu wandern. Bei Untersuchungen der induzierten Schwarmmotilität ist die spezifische Konzentration eines Induktors möglicherweise nicht in der Lage, Ereignisse zu melden, die innerhalb des optimalen Konzentrationsbereichs auftreten, um die gewünschten Reaktionen einer Spezies hervorzurufen. Halbfeste Platten, die mehrere Konzentrationen enthalten, werden üblicherweise verwendet, um die Reaktion innerhalb eines Induktorkonzentrationsbereichs zu untersuchen. Separate halbfeste Platten erhöhen jedoch die Schwankungen der mittleren Viskosität und des Feuchtigkeitsgehalts innerhalb jeder Platte aufgrund der ungleichmäßigen Erstarrungszeit.
Dieses Papier beschreibt eine einstufige Methode zum gleichzeitigen Testen der Motilität des Oberflächenschwärmens auf einer einzelnen Gradientenplatte, wobei die isometrisch angeordneten Testvertiefungen die gleichzeitige Erfassung von Multikonzentrationsreaktionen ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Oberflächenschwärme von Escherichia coli K12 und Pseudomonas aeruginosa PAO1 als Reaktion auf einen Konzentrationsgradienten von Induktoren wie Resveratrol und Arabinose untersucht. In regelmäßigen Abständen wurden die Schwarmmorphologien mit einem Bildgebungssystem abgebildet, um den gesamten Oberflächenschwarmprozess zu erfassen.
Die quantitative Messung der Schwarmmorphologien wurde mit der ImageJ-Software erfasst und lieferte analysierbare Informationen über das Schwarmgebiet. Dieses Papier stellt eine einfache Gradientenschwarmplattenmethode vor, die qualitative und quantitative Informationen über die Auswirkungen der Induktoren auf die Oberflächenschwärme liefert, die erweitert werden können, um die Auswirkungen anderer Induktoren auf ein breiteres Spektrum beweglicher Bakterienarten zu untersuchen.
Introduction
Die bakterielle Schwarmmotilität bezieht sich auf die kollektive Migration von Bakterienzellen über die Oberfläche einer Substanz. Neben halbfesten Agarplatten, die speziell im Labor hergestellt wurden1, wird dieser Phänotyp auch auf einigen weichen Substraten wie tierischem Gewebe2, hydratisierten Oberflächen3 und Pflanzenwurzeln beobachtet4. Während eine halbfeste Oberfläche als eine der Grundbedingungen für bakterielle Schwärme gilt, benötigen einige Arten auch ein energiereiches Medium, um ihre Schwarmmotilität zu unterstützen5. Flagellenrotation treibt sowohl Schwimmen als auch Schwärmen Motilität an – Schwimmen beschreibt die einzellige Motilität innerhalb einer flüssigen Umgebung, während Schwärmen die synchrone Bewegung einer mikrobiellen Population über halbfeste Oberflächen ist.
Die Substratviskosität beeinflusst die bakterielle Motilität; Studien an pathogenen Mikroben wie Helicobacter pylori haben gezeigt, dass sich die Motilität des Erregers in Abhängigkeit von der Viskosität der Mucinschicht ändert, die durch die Versauerung der Umwelt im menschlichen Wirt beeinflusst wird6. Um diese Umgebungen zu replizieren, beschränken frühere Studien mit einer Agarkonzentration über 0,3% (w / v) die bakterielle Schwimmmotilität, um eine allmähliche Verschiebung in die Oberflächenschwärme zu bewirken. Die Verwendung einer Agarkonzentration über 1% (w/v) verhindert die Schwarmmotilität vieler Arten7. Die auf der Oberfläche gebildeten Koloniemuster sind vielfältig, darunter featureless mat8, bull’s eye9, Dendrites10 und vortex11.
Obwohl die Relevanz solcher Muster unklar bleibt, scheinen diese Muster von umweltbedingten und chemischen Hinweisen abhängig zu sein12. Umwelthinweise decken verschiedene Aspekte ab, einschließlich Temperatur, Salzgehalt, Licht und pH-Wert, während chemische Hinweise das Vorhandensein von mikrobiellen Quorum Sensing-Molekülen, biochemischen Nebenprodukten und Nährstoffen umfassen. Autoinduktor-Quorum-Sensing-Signalmoleküle wie AHL (N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton) können das Schwärmen der Oberfläche beeinflussen, indem sie die Produktion von Tensid regulieren13,14. Resveratrol, eine Phytoalexinverbindung, könnte die Motilität des bakteriellen Schwärmens einschränken15.
In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die Wirkung von Gradientenkonzentrationen von Resveratrol auf den Wildtyp-Escherichia coli K12-Stamm und untersuchen die Arabinose-induzierbare Schwarmmotilität von technisch hergestellten E. coli K12-YdeH- und Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-Arten. Die Produktion des YdeH-Enzyms wird durch Arabinose über den araBAD-Promotor induziert, was zu einer zellulären c-di-GMP-Störung führt und die bakterielle Schwarmmotilität beeinflusst16,17. Dieses induzierbare Schwarmverhalten wird unter Verwendung von Arabinose-Gradienten-Schwarmplatten mit E. coli K12-YdeH- und P. aeruginosa PAO1-YdeH-Stämmen untersucht.
Die Gradientenschwarmplatten werden durch sukzessives Erstarren von doppellagigem Medium hergestellt (Abbildung 1B). Die untere Schicht besteht aus dem mit dem Induktor hinzugefügten Medium, das auf eine Seite einer abgestützten Petrischale gegossen wird. Nach dem Erstarren der unteren Schicht wird die Petrischale auf eine ebene Oberfläche zurückgeführt, wobei die obere Schicht, die das Medium ohne den Induktor enthält, von der anderen Seite der Platte hinzugefügt wird. Nachdem die Schwarmplatten vollständig verfestigt sind, werden isometrisch angeordnete Haltebrunnen erzeugt, indem Löcher auf die Schwarmplatten nach einem festen Layout gebohrt werden (Abbildung 1C) oder indem die Vertiefungen mit einem 3D-gedruckten Modell der Plattenabdeckung, die Stifte enthält, während des mittleren Aushärtungsprozesses bedruckt werden (Ergänzende Abbildung S1). Ein Gelbildgebungssystem wird verwendet, um die Schwarmmorphologien zu verschiedenen Zeitpunkten zu erfassen (Abbildung 2). Die Analyse des Oberflächenschwärmens mit der ImageJ-Software (Supplemental Figure S2) liefert quantitative Ergebnisse des Oberflächenschwarmprozesses (Abbildung 3).
Daher schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Motilität des Oberflächenschwärmens innerhalb eines Konzentrationsbereichs von Induktoren zu testen. Diese Methode kann verwendet werden, um mehrere Konzentrationsreaktionen anderer Induktoren zu testen, indem der Induktor in das Medium der unteren Schicht gemischt wird, und kann auf andere bewegliche Spezies (z. B. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica) angewendet werden. Dieser Ansatz könnte zuverlässige qualitative und quantitative Ergebnisse für das Screening eines einzelnen chemischen Induktors liefern, und separate Platten können verwendet werden, um mehr chemische Induktoren zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung der bakteriellen Schwarmmotilität auf halbfesten Gradientenplatten kann eine herausfordernde Aufgabe sein18,19,20, da sie mehrere Faktoren wie Substratviskosität, Feuchtigkeit und mittlere Komponenten umfasst. Unter diesen Faktoren spielt die Agarkonzentration eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der mikrobiellen Rückkehr zur Schwimm- oder Schwarmmotilität. Wenn die Agarkonzentration von 0,3% (w/v) a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Entwicklung dieser Technik wurde durch die Mittel des National Key R&D Plan (2018YF0902604) des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, des Forschungsfonds für internationale Nachwuchswissenschaftler (22050410270) der National Natural Science Foundation of China und der Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001) unterstützt. Wir möchten Frau Chen Xinyi unseren aufrichtigen Dank für ihre Unterstützung beim Korrekturlesen des Dokuments und des Labormanagements aussprechen.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
