Kvantifisere bakteriell overflate swarming motility på inducer gradient plater
Summary
Her beskriver vi bruken av inducer gradient plater for å evaluere bakteriell swarming motility samtidig oppnå flere konsentrasjonsresponser.
Abstract
Bakteriell swarming motility er en vanlig mikrobiologisk fenotype som bakterielle samfunn bruker til å migrere over halvsolide overflater. I undersøkelser av indusert swarming motility, kan spesifikk konsentrasjon av en induser ikke være i stand til å rapportere hendelser som forekommer innenfor det optimale konsentrasjonsområdet for å fremkalle de ønskede svarene fra en art. Halvsolide plater som inneholder flere konsentrasjoner, brukes vanligvis til å undersøke responsen innenfor et induserkonsentrasjonsområde. Imidlertid øker separate halvsolide plater variasjoner i middels viskositet og fuktighetsinnhold i hver plate på grunn av ikke-enhetlig størkningstid.
Dette dokumentet beskriver en ett-trinns metode for samtidig å teste overflatesvermende motilitet på en enkelt gradientplate, der de isometrisk arrangerte testbrønnene tillater samtidig oppkjøp av multikonsentrasjonsresponser. I det nåværende arbeidet ble overflaten swarming av Escherichia coli K12 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 evaluert som svar på en konsentrasjonsgradient av indusere som resveratrol og arabinose. Periodisk ble svermmorfologiene avbildet ved hjelp av et bildesystem for å fange hele overflatesvermprosessen.
Den kvantitative målingen av svermmorfologiene ble anskaffet ved hjelp av ImageJ-programvare, og ga analyserbar informasjon om svermområdet. Dette papiret presenterer en enkel gradient sverm plate metode som gir kvalitativ og kvantitativ informasjon om indusere effekter på overflaten swarming, som kan utvides til å studere effekten av andre indusere på et bredere spekter av motile bakterielle arter.
Introduction
Bakteriell swarming motility refererer til den kollektive migrasjonen av bakterieceller over overflaten av et stoff. I tillegg til halvsolid agarplater spesielt tilberedt i laboratoriet1, observeres denne fenotypen også på noen myke substrater som dyrevev2, hydrerte overflater3 og planterøtter4. Mens en semisolid overflate regnes som en av de grunnleggende forholdene for bakteriell swarming, krever noen arter også et energirikt medium for å støtte deres swarming motility5. Flagella rotasjon driver både svømming og swarming motility-svømming beskriver den encellede motiliteten i et flytende miljø, mens swarming er den synkrone bevegelsen av en mikrobiell befolkning over halvsolide overflater.
Substrat viskositet påvirker bakteriell bevegelighet; studier av patogene mikrober, som Helicobacter pylori, har vist at patogenets motilitet endres avhengig av mucinlagets viskositet, som påvirkes av miljøforsuring i den menneskelige verten6. For å gjenskape disse miljøene begrenser tidligere studier ved hjelp av agarkonsentrasjon over 0,3% (w / v) bakteriell svømmemotilitet for å påvirke et gradvis skifte til overflatesverm. Bruken av agarkonsentrasjon over 1% (w / v) forhindrer den svermende motiliteten til mange arter7. Kolonimønstrene som dannes på overflaten er varierte, inkludert funksjonsløs mat8, oksens øye9, dendritter10 og virvel11.
Selv om relevansen av slike mønstre fortsatt er uklar, synes disse mønstrene å være avhengige av miljømessige og kjemiske signaler12. Miljøsignaler dekker ulike aspekter, inkludert temperatur, saltholdighet, lys og pH, mens kjemiske signaler inkluderer tilstedeværelsen av mikrobielle quorumssensormolekyler, biokjemiske biprodukter og næringsstoffer. Autoinducer quorum sensing signalmolekyler som AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) kan påvirke overflaten swarming ved å regulere produksjonen av surfactant13,14. Resveratrol, en fytoalexin sammensatte, kan begrense bakteriell swarming motility15.
I det nåværende arbeidet undersøker vi effekten av gradientkonsentrasjoner av resveratrol på villtype Escherichia coli K12-stamme og undersøker arabinose-inducible swarming motility av konstruerte E. coli K12-YdeH og Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH arter. Produksjonen av YdeH-enzymet induseres av arabinose via araBAD-promotoren, noe som resulterer i cellulær c-di-GMP-perturbasjon og påvirker bakteriell swarmingmotilitet16,17. Denne inducible swarming oppførselen studeres ved hjelp av arabinose gradient swarm plater med E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer.
Gradientsvermplatene fremstilles ved suksessivt størkning av dobbeltlagsmedium (figur 1B). Bunnlaget består av mediet som er tilsatt med induseren, helles på den ene siden av en propped-up Petri-tallerken. Ved størkning av bunnlaget returneres Petri-parabolen til en flat overflate, hvor det øvre laget som inneholder mediet uten induseren, tilsetts fra den andre siden av platen. Etter at sværmplatene er fullstendig størknet, produseres isometrisk arrangerte holdebrønner ved boring av hull på sværmeplatene etter en fast layout (figur 1C) eller ved å trykke brønnene ved hjelp av en 3D-trykt modell av platedekselet som inneholder pinner under middels herdeprosess (Supplerende figur S1). Et gelavbildningssystem brukes til å fange de svermende morfologiene på forskjellige tidspunkter (figur 2). Analyse av overflatesverm ved hjelp av ImageJ-programvare (Supplemental Figure S2) gir kvantitative resultater av overflatesvermprosessen (figur 3).
Dermed foreslår vi en enkel metode for å teste overflatesvermende bevegelighet innenfor et konsentrasjonsområde av indusere. Denne metoden kan brukes til å teste flere konsentrasjonsresponser fra andre indusere ved å blande induseren inn i bunnlagsmediet og kan brukes på andre motile arter (f.eks. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Denne tilnærmingen kan gi pålitelige kvalitative og kvantitative resultater for screening av en enkelt kjemisk induser, og separate plater kan brukes til å evaluere flere kjemiske indusere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøkelse av bakteriell swarming motility på semisolid gradient plater kan være en utfordrende oppgave18,19,20, da det innebærer flere faktorer som substrat viskositet, fuktighet og mellomstore komponenter. Blant disse faktorene spiller agarkonsentrasjon en avgjørende rolle i å bestemme mikrobiell tilbakevending til enten svømming eller swarming motilitet. Etter hvert som agarkonsentrasjonen øker fra 0,3 % (w/v) til 1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utviklingen av denne teknikken ble støttet av midlene fra Vitenskaps- og teknologidepartementets National Key FoU-plan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China’s Research Fund for International Young Scientists (22050410270) og Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vil gjerne gi vår oppriktige takknemlighet til Miss Chen Xinyi for hennes hjelp til å korrekturlese dokumentet og laboratorieledelsen.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
Referências
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. Swarming motility in plant-associated bacteria. Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al., Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. , 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
