뮤린 대퇴목의 캔틸레버 굽힘
Summary
본 프로토콜은 캔틸레버 굽힘 설정에서 뮤린 대퇴목에 대한 재현 가능한 테스트 플랫폼의 개발을 설명합니다. 사용자 지정 3D 인쇄 가이드는 최적의 정렬로 대퇴골을 일관되고 엄격하게 고정하는 데 사용되었습니다.
Abstract
대퇴목의 골절은 골다공증을 가진 개별에서 일반적입니다. 많은 마우스 모형은 1 차적인 결과 측정으로 생체 기계시험을 가진 질병 상태 및 치료를 평가하기 위하여 개발되었습니다. 그러나 전통적인 생체 기계 테스트는 긴 뼈의 중간 축에 적용되는 비틀림 또는 굽힘 테스트에 중점을 둡니다. 이것은 일반적으로 골다공증 개별에 있는 고위험 골절의 사이트 아닙니다. 따라서, 골다공증 환자가 경험하는 골절의 유형을 더 잘 복제하기 위해 캔틸레버 굽힘 로딩에서 뮤린 대퇴골의 대퇴골목을 테스트하는 생체 기계적 테스트 프로토콜이 개발되었다. 생체 역학적 결과는 대퇴목에 비해 굴곡 적재 방향에 크게 의존하기 때문에, 3D 프린팅 가이드는 적재 방향에 비해 20° 각도로 대퇴 샤프트를 유지하기 위해 만들어졌습니다. 새로운 프로토콜은 정렬의 가변성을 감소시킴으로써 테스트를 간소화 (21.6 ° ± 1.5 °, COV = 7.1%, n = 20) 측정 된 생체 역학 결과 (평균 COV = 26.7 %). 신뢰할 수 있는 시편 정렬을 위한 3D 프린팅 가이드를 사용하는 새로운 접근 방식은 골다공증의 마우스 연구에서 샘플 크기를 최소화해야 하는 시편 정렬 불량으로 인한 측정 오류를 줄임으로써 엄격성과 재현성을 향상시킵니다.
Introduction
골절 위험은 골다공증과 관련된 심각한 의학적 관심사입니다. 150만 개 이상의 취약성 골절은 미국에서만 매년 보고되며, 엉덩이, 특히 대퇴목에서 주요 골절 유형1이 발생하는 골절이 발생합니다. 여성의 18%와 남성의 6%가 일생동안 대퇴목 골절을 경험할 것으로 추정되며, 골절 후 1년차 사망률은 20%1보다 큽습니다. 따라서 대퇴목의 생체 역학 적 테스트를 허용하는 마우스 모델은 취약성 골절을 연구하는 데 적합 할 수 있습니다. 마우스 모델은 또한 잠재적으로 골다공증에 관련된 번역 가능한 세포 및 분자 사건을 해명하기 위하여 강력한 공구를 제공합니다. 이것은 유전 기자의 가용성, 기능 모델의 이득 및 손실, 분자 기술 및 시약의 광대 한 라이브러리 때문입니다. 마우스 뼈의 기계적 테스트는 질병의 병인학을 설명할 수 있는 뼈 건강, 지장및 현상 변이를 결정하는 데 필요한 결과 측정을 제공하고, 뼈의 질과 골절의 위험의 결과 측정에 근거하여 치료를 평가할 수 있습니다3.
대퇴목의 해부학은 일반적으로 굴곡 (굽힘) 골절로 이어지는 독특한 기계적 적재 시나리오를 만듭니다. 대퇴골 머리는 대퇴골의 근간 끝에 있는 아세타큘러 소켓에 적재됩니다. 이것은 대퇴목의 캔틸레버 굽힘 시나리오를 생성하며, 이는 대퇴샤프트에 엄격하게 부착됩니다4. 이것은 대퇴골 중간 diaphysis에 전통적인 3- 또는 4 점 굽힘 시험과 다릅니다. 이러한 테스트는 도움이 되지만 일반적으로 골절 위치 또는 로딩 시나리오 측면에서 골다공증 및 골다공증 개인의 취약성 골절로 이어지는 로딩을 복제하지는 않습니다.
쥐의 취약성 골절 위험을 더 잘 평가하기 위해, 그것은 뮤린 대퇴목의 캔틸레버 굽힘 테스트의 재현성을 개선하기 위해 노력했다. 이론적으로 예측된 바와 같이, 대퇴샤프트에 비해 대퇴골 헤드의 적재각도가 결과측정값에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이로 인해 보고된 결과의 신뢰성과 재현성에 대한 도전이 생기다. 시료 준비 중 대퇴골의 적절하고 일관된 정렬을 보장하기 위해 C57BL/6 마우스 대퇴골의 μCT 스캔에 따라 3D 인쇄된 가이드를 설계했습니다. 가이드는 대퇴 샤프트가 수직 적재 방향에서 ~20° 유지되도록 일관되게 샘플을 포팅하는 데 도움을 주도록 설계되었습니다. 이 각도는 대퇴목 골절의 가능성을 높이고 보다 일관되고 재현 가능한 테스트5로 이어지는 대퇴골 샤프트를 따라 최대 굽힘 순간을 최소화하면서 강성을 극대화하기 때문에 선택되었습니다. 가이드는 샘플 간의 해부학적 차이를 수용하기 위해 다양한 크기로 3D 인쇄되었으며 아크릴 뼈 시멘트에서 포팅하는 동안 샘플을 안정적인 위치에 보관하는 데 사용되었습니다. 강성, 최대 힘, 수율 력 및 최대 에너지는 힘 변위 그래프에서 계산되었습니다. 이 테스트 방법은 전술한 생체 역학적 결과에 대한 일관된 결과를 보여주었다. 3D 프린팅 가이드의 연습과 도움으로 정렬 불량으로 인한 측정 오류를 최소화하여 신뢰할 수 있는 결과 측정을 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 뮤린 대퇴목에 대한 신뢰할 수있는 캔틸레버 굽힘 테스트를 간략하게 설명합니다. 대퇴목에서 발생하는 천연 캔틸레버 플렉스 시나리오는 일반적으로 표준 3점 및 4점 굽힘 테스트5에서 표현되지 않습니다. 이 시험 방법은 뼈 취약성 환자에 의해 경험된 대퇴목 골절의 모형을 더 좋고 더 안정적으로 복제합니다. 이 프로토콜을 수행할 때 주요 초점은 대퇴샤프트의…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH P30AR069655 및 R01AR070613(H. A.A.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
Referências
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