Curva cantilever de pescoços femorais murinos

Summary

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de uma plataforma de teste reprodutível para pescoços femorais murinos em uma configuração de dobra cantilever. Guias impressos 3D personalizados foram usados para fixar de forma consistente e rígida os fêmures no alinhamento ideal.

Abstract

Fraturas no pescoço femoral são uma ocorrência comum em indivíduos com osteoporose. Muitos modelos de camundongos foram desenvolvidos para avaliar estados e terapias da doença, com testes biomecânicos como medida de desfecho primário. No entanto, os testes biomecânicos tradicionais se concentram em testes de torção ou dobra aplicados no eixo médio dos ossos longos. Este não é tipicamente o local de fraturas de alto risco em indivíduos osteoporóticos. Assim, foi desenvolvido um protocolo de teste biomecânico que testa os pescoços femorais dos fêmures murinas no carregamento de dobra cantilever para replicar melhor os tipos de fraturas experimentadas pelos pacientes com osteoporose. Uma vez que os desfechos biomecânicos são altamente dependentes da direção de carga flexural em relação ao pescoço femoral, foram criadas guias impressas em 3D para manter um eixo femoral em um ângulo de 20° em relação à direção de carga. O novo protocolo agilizou os testes reduzindo a variabilidade no alinhamento (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) e melhor reprodutibilidade nos desfechos biomecânicos medidos (COV médio = 26,7%). A nova abordagem utilizando as guias impressas em 3D para um alinhamento confiável da amostra melhora o rigor e a reprodutibilidade, reduzindo os erros de medição devido ao desalinhamento da amostra, o que deve minimizar o tamanho da amostra em estudos de camundongos de osteoporose.

Introduction

O risco de fratura é uma preocupação médica séria associada à osteoporose. Mais de 1,5 milhão de fraturas por fragilidade são relatadas a cada ano apenas nos Estados Unidos, com fraturas ocorrendo no quadril, especificamente no pescoço do fêmur, como a fratura principal ^tipo1. Estima-se que 18% das mulheres e 6% dos homens sofrerão uma fratura no pescoço femoral durante a ^vida2, e a taxa de mortalidade em 1 ano após a fratura é superior a 20%¹. Portanto, modelos de camundongos que permitem testes biomecânicos do pescoço femoral podem ser adequados para o estudo de fraturas de fragilidade. Modelos de camundongos também oferecem ferramentas poderosas para elucidar eventos celulares e moleculares traduzíveis envolvidos na osteoporose potencialmente. Isso se deve à disponibilidade de repórteres genéticos, ao ganho e perda de modelos de função e à extensa biblioteca de técnicas moleculares e reagentes. Testes mecânicos de ossos de camundongos podem fornecer medidas de desfecho necessárias para determinar a saúde óssea, variações genotípicas e fenotípicas que poderiam explicar a etiologia da doença, e avaliar terapias baseadas em medidas de desfecho da qualidade do osso e do risco de ^fratura3.

A anatomia do pescoço femoral cria cenários de carregamento mecânico únicos, que normalmente levam a fraturas flexis (dobras). A cabeça femoral é carregada no soquete acetabular na extremidade proximal do fêmur. Isso cria um cenário de dobra cantilever no pescoço femoral, que é rigidamente ligado ao eixo femoral ^distally4. Isso difere dos testes tradicionais de dobra de 3 ou 4 pontos na diafísica média femoral. Embora esses testes sejam úteis, eles não replicam o carregamento que normalmente leva a fraturas de fragilidade em indivíduos osteopenicos e osteoporóticos em termos de localização da fratura ou do cenário de carregamento.

Para avaliar melhor o risco de fratura de fragilidade em camundongos, buscou-se melhorar a reprodutibilidade dos testes de dobra cantilever dos pescoços femorais murinos. Como teoricamente previsto, o ângulo de carga na cabeça femoral em relação ao eixo femoral tem sido mostrado para afetar significativamente as medidas de ^desfecho5, criando assim um desafio para a confiabilidade e reprodutibilidade dos desfechos relatados. Para garantir o alinhamento adequado e consistente dos fêmures durante a preparação da amostra, foram projetadas guias e impressas em 3D com base em medições anatômicas feitas em escaneamentos μCT de fêmures de camundongos C57BL/6. Os guias foram projetados para ajudar a envasar consistentemente as amostras de modo que o eixo femoral seja mantido a ~20° da direção de carga vertical. Este ângulo foi escolhido porque maximiza a rigidez ao minimizar o momento de dobra máxima ao longo do eixo femoral, o que aumenta a probabilidade de fraturas no pescoço femoral e leva a testes mais consistentes e ^{reprodutíveis5}. Os guias foram impressos em 3D em vários tamanhos para acomodar diferenças anatômicas entre as amostras e usados para segurar amostras em posição estável enquanto enloucotado em cimento ósseo acrílico. A rigidez, força máxima, força de rendimento e energia máxima foram calculadas a partir dos gráficos de deslocamento de força. Este método de teste mostrou resultados consistentes para o resultado biomecânico acima mencionado. Com a prática e o auxílio do guia impresso em 3D, erros de medição devido ao desalinhamento podem ser minimizados, resultando em medidas de resultado confiáveis.

Protocol

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos utilizados neste estudo foram C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 24 e 29 semanas de idade. Os ratos estavam alojados em condições padrão com comida e água ad libitum. Após a eutanásia por inalação de dióxido de carbono, seguida de luxação cervical, 20 fêmures direito (10 machos e 10 fêmeas) foram colhidos e congelados a -20 °C até serem testados. <stro…

Representative Results

Quando em vasos com o auxílio do guia, os eixos femorais foram alinhados em 21,6° ± 1,5°. Embora isso represente < 10% de desvio do ângulo pretendido de 20°, os coeficientes de variação (COV) do ângulo de vaso em todas as amostras testadas foram de 7,6% e 6,5% para camundongos machos e fêmeas, respectivamente (n = 10 por grupo) conforme verificado por raios-x planar pré-teste (Figura 5). Além disso, os raios-X pós-teste devem ser usados para avaliar o modo em que as amostras fal…

Discussion

Este protocolo descreve um teste de dobra cantilever confiável para pescoços femorais murinos. O cenário natural de flexão cantilever que ocorre no pescoço femoral normalmente não é representado nos testes de dobra padrão de 3 e 4 ^pontos5. Este método de teste é melhor e mais confiável replica o tipo de fraturas do pescoço femoral experimentadas por pacientes com fragilidade óssea. O foco principal ao executar este protocolo é eliminar a variabilidade devido ao vaso inconsistente do …

Materials

¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.