快速高尔基染色用于海马体和前额叶皮层树突状脊柱可视化
Summary
该协议描述了快速高尔基体方法的修改，该方法可以适应神经系统的任何部分，用于染色大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的神经元。
Abstract
高尔基体浸渍，使用具有轻微适应的高尔基染色试剂盒，用于浸渍大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的树突状棘。这种技术比以前的高尔基体浸渍方法有了显着的改进，因为预混合的化学物质使用起来更安全，神经元始终浸渍良好，背景碎片少得多，并且对于给定的区域，实验之间的脊柱密度存在极小的偏差。此外，大脑可以在某一点后积累并保持冷冻，直到进一步处理。使用这种方法可以研究任何感兴趣的大脑区域。一旦染色并覆盖滑动，树突状脊柱密度通过计算树突长度的棘数量来确定，并表示为每10μm树突的脊柱密度。
Introduction
使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法首先由Camillo Golgi1，2 描述，随后由Santiago Ramon y Cajal使用，以产生大量区分神经元和神经胶质亚型的工作。最近出版的一本附有他的插图的书现已出版3.在100多年前发表的Ramon y Cajal的研究之后，很少使用高尔基体浸渍。高尔基体浸渍是一个费力的过程，允许用光学显微镜对神经元进行三维可视化。多年来，高尔基体方法进行了多次修改，使方法更容易，染色更一致4。1984年，Gabbott和Somogyi5 描述了单段高尔基体浸渍程序，该程序允许更快速的加工。这种高尔基体浸渍方法需要用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸灌注，固定后，然后振动切片到3%重铬酸钾浴中。切片安装在载玻片上，盖玻片的四个角粘合在一起，以便当浸入硝酸银中时，扩散是渐进的。然后将盖玻片弹出，部分脱水，并最终用安装介质永久滑落盖板。该技术被成功地用于标记海马体中的神经元和神经胶质细胞6，7，8 。这里描述的快速高尔基体方法是一种改进，因为重铬酸钾和硝酸银的暴露要少得多，并且不使用多聚甲醛和苦味酸。此外，尽管可以使用Gabbott和Somogyi5 方法的修饰来浸渍的细胞进行分析，但在脱水步骤中，切片通常过度或未充分暴露或从载玻片上掉落，并且通常必须合并几个实验以具有足够的细胞进行分析。
本方案描述了使用高尔基染色试剂盒（见 材料表）来标记大鼠海马体和内侧前额叶皮层（mPFC）中的树突和树突状棘。与以前的方法相比，这种方法的优点是它速度快，研究人员接触有毒化学物质较少，并且神经元染色一致。在许多研究中，下面描述的方案已被用于进行微小的修改，以评估大鼠海马体和mPFC中的树突状脊柱密度9，10，11，12，13，14，15。
Protocol
所有实验程序均由圣心大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合NIH动物护理和使用指南。 1. 脑组织的分离和浸润 使用前24小时高尔基体染色试剂盒的预混溶液A和B，并保存在深色瓶中和/或黑暗中。制作约80 mL溶液A和B混合物，足以在24小时后更换溶液。存放在密封瓶中。注意：不需要用盐水或多聚甲醛灌注。 在二氧化碳安乐死后通过断头台?…
Representative Results
使用快速高尔基体方法，细胞始终被很好地浸渍，以便有足够的细胞进行分析。与以前的方法相比，这是一个显着的改进，在以前的方法中，必须将实验合并以具有足够的数据进行分析。因此，可以一次处理更多的样品，并且可以冷冻储存大脑直到处理。 图3显示了海马体CA1区域中高尔基体浸渍细胞在低功率和高功率下的例子。对给定区域中的棘进行计数可以产生具有小标?…
Discussion
本方案描述了一种高尔基体浸渍方法，该方法允许快速同时处理许多切片。这是对前面描述的5 种劳动密集型方法的改进，并且始终产生浸渍神经元进行分析。此外，接触高尔基体浸渍中使用的有毒化学物质较少。该过程中最具挑战性的部分是使切片在幻灯片上保持平坦，这需要大量的练习。使用冷冻喷雾保持所有东西尽可能冷是至关重要的。
一旦载玻片干…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了圣心大学本科生研究计划Grants的支持。
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Referências
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Citar este artigo
Frankfurt, M., Bowman, R. Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex. J. Vis. Exp. (178), e63404, doi:10.3791/63404 (2021).