Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex
Summary
Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.
Abstract
Golgi-impregnatie, met behulp van de Golgi-kleuringskit met kleine aanpassingen, wordt gebruikt om dendritische stekels in de hippocampus van de rat en de mediale prefrontale cortex te impregneren. Deze techniek is een duidelijke verbetering ten opzichte van eerdere methoden van Golgi-impregnatie omdat de voorgemengde chemicaliën veiliger zijn om te gebruiken, neuronen consequent goed geïmpregneerd zijn, er veel minder achtergrondresten zijn en voor een bepaald gebied zijn er extreem kleine afwijkingen in de wervelkolomdichtheid tussen experimenten. Bovendien kunnen hersenen na een bepaald punt worden opgehoopt en bevroren worden gehouden tot verdere verwerking. Met behulp van deze methode kan elk hersengebied van belang worden bestudeerd. Eenmaal gekleurd en bedekt, wordt de dendritische wervelkolomdichtheid bepaald door het aantal stekels voor een lengte van dendriet te tellen en uitgedrukt als wervelkolomdichtheid per 10 μm dendriet.
Introduction
De methode voor het gebruik van kaliumdichromaat en zilvernitraat om neuronen te labelen werd voor het eerst beschreven door Camillo Golgi 1,2 en vervolgens gebruikt door Santiago Ramon y Cajal om een immens oeuvre te produceren dat neuronale en gliale subtypen onderscheidt. Een recent verschenen boek met zijn illustraties is nu beschikbaar3. Na de studies van Ramon y Cajal, die meer dan 100 jaar geleden werden gepubliceerd, werd zeer weinig Golgi-impregnatie gebruikt. Golgi-impregnatie is een moeizaam proces dat driedimensionale visualisatie van neuronen met een lichtmicroscoop mogelijk maakt. Er zijn in de loop der jaren talloze wijzigingen van de Golgi-methode geweest om de methode gemakkelijker te maken en de kleuring consistenter4. In 1984 beschreven Gabbott en Somogyi5 de eensectie Golgi-impregnatieprocedure die een snellere verwerking mogelijk maakte. Deze Golgi-impregnatiemethode vereist perfusie met 4% paraformaldehyde en 1,5% picrinezuur, postfixatie gevolgd door vibratome-sectie in een bad van 3% kaliumdichromaat. Secties worden gemonteerd op glazen dia’s, de vier hoeken van coverslips gelijmd zodat bij onderdompeling in zilvernitraat de diffusie geleidelijk verloopt. Coverslips worden vervolgens afgeklapt, secties worden uitgedroogd en uiteindelijk permanent afgedekt met montagemedium. Deze techniek werd met succes gebruikt om neuronen en glia 6,7,8 in de hippocampus te labelen. De hier beschreven snelle Golgi-methode is een verbetering omdat er veel minder blootstelling is aan zowel kaliumdichromaat als zilvernitraat en er geen paraformaldehyde en picrinezuur worden gebruikt. Bovendien, hoewel cellen die werden geïmpregneerd met behulp van modificaties van de Gabbott- en Somogyi5-methode konden worden geanalyseerd, waren de secties vaak over- of onderbelicht of vielen ze van de dia’s tijdens de uitdrogingsstap en over het algemeen moesten verschillende experimenten worden samengevoegd om voldoende cellen voor analyse te hebben.
Het huidige protocol beschrijft het gebruik van de Golgi-kleuringskit (zie Materiaaltabel) om dendrieten en dendritische stekels in de hippocampus en mediale prefrontale cortex (mPFC) van de rat te labelen. De voordelen van deze methode ten opzichte van eerdere zijn dat het snel is, er minder blootstelling is aan schadelijke chemicaliën voor de onderzoeker en er is consistente kleuring van neuronen. Het hieronder beschreven protocol is met kleine wijzigingen gebruikt om de dendritische wervelkolomdichtheid in de hippocampus en mPFC van de rat te beoordelen in vele onderzoeken 9,10,11,12,13,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een methode van Golgi-impregnatie die een snelle gelijktijdige verwerking van vele secties mogelijk maakt. Het is een verbetering ten opzichte van eerder beschreven5 meer arbeidsintensieve methoden en levert consequent geïmpregneerde neuronen op voor analyse. Bovendien is er minder blootstelling aan giftige chemicaliën die worden gebruikt bij Golgi-impregnatie. Het meest uitdagende deel van het proces is om de secties plat op de dia’s te krijgen, wat veel oefening…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Referências
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
