हिप्पोकैम्पस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में डेंड्राइटिक स्पाइन विज़ुअलाइज़ेशन के लिए रैपिड गोल्गी स्टेन
Summary
प्रोटोकॉल तेजी से गोल्गी विधि के एक संशोधन का वर्णन करता है, जिसे हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स और चूहे के औसत दर्जे के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स को धुंधला करने के लिए तंत्रिका तंत्र के किसी भी हिस्से के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
गोल्गी गर्भाधान, मामूली अनुकूलन के साथ गोल्गी स्टेनिंग किट का उपयोग करके, चूहे हिप्पोकैम्पस और औसत दर्जे के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में डेंड्राइटिक स्पाइन को गर्भवती करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह तकनीक गोल्गी गर्भाधान के पिछले तरीकों पर एक उल्लेखनीय सुधार है क्योंकि प्रीमिक्स्ड रसायनों का उपयोग करना सुरक्षित है, न्यूरॉन्स लगातार अच्छी तरह से गर्भवती हैं, बहुत कम पृष्ठभूमि मलबे हैं, और किसी दिए गए क्षेत्र के लिए, प्रयोगों के बीच रीढ़ की हड्डी के घनत्व में बेहद छोटे विचलन हैं। इसके अलावा, मस्तिष्क को एक निश्चित बिंदु के बाद जमा किया जा सकता है और आगे के प्रसंस्करण तक जमे हुए रखा जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके ब्याज के किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र का अध्ययन किया जा सकता है। एक बार दाग और कवर फिसल जाने के बाद, डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व डेंड्राइट की लंबाई के लिए स्पाइन की संख्या की गिनती करके निर्धारित किया जाता है और प्रति 10 μm डेंड्राइट प्रति रीढ़ के घनत्व के रूप में व्यक्त किया जाता है।
Introduction
न्यूरॉन्स को लेबल करने के लिए पोटेशियम डाइक्रोमेट और सिल्वर नाइट्रेट का उपयोग करने की विधि को पहले कैमिलो गोल्गी 1,2 द्वारा वर्णित किया गया था और बाद में सैंटियागो रेमन वाई कैजल द्वारा न्यूरोनल और ग्लियाल उपप्रकारों को अलग करने वाले काम के एक विशाल शरीर का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया गया था। उनके चित्रों के साथ हाल ही में प्रकाशित एक पुस्तक अब उपलब्ध है3. रेमन वाई कैजल के अध्ययन के बाद, जो 100 से अधिक साल पहले प्रकाशित हुए थे, बहुत कम गोल्गी गर्भाधान का उपयोग किया गया था। गोल्गी गर्भाधान एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है जो प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ न्यूरॉन्स के तीन आयामी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। विधि को आसान बनाने और धुंधला अधिक सुसंगत 4 बनाने के लिए वर्षों से गोल्गी विधि के कई संशोधन किए गएहैं। 1984 में, Gabbott और Somogyi5 ने एकल अनुभाग गोल्गी गर्भाधान प्रक्रिया का वर्णन किया जो अधिक तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है। इस गोल्गी गर्भाधान विधि को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड और 1.5% पिक्रिक एसिड के साथ परफ्यूजन की आवश्यकता होती है, पोस्ट-फिक्सेशन के बाद 3% पोटेशियम डाइक्रोमेट के स्नान में वाइब्रेट सेक्शनिंग होता है। अनुभागों को कांच की स्लाइड पर लगाया जाता है, कवरस्लिप के चार कोनों को चिपकाया जाता है ताकि जब चांदी के नाइट्रेट में डुबोया जाए, तो प्रसार क्रमिक हो। Coverslips तो बंद popped कर रहे हैं, वर्गों निर्जलित कर रहे हैं, और अंततः कवर स्थायी रूप से बढ़ते माध्यम के साथ फिसल गया. इस तकनीक का सफलतापूर्वक हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स और ग्लिया 6,7,8 लेबल करने के लिए उपयोग किया गया था। यहां वर्णित तेजी से गोल्गी विधि एक सुधार है क्योंकि पोटेशियम डाइक्रोमेट और सिल्वर नाइट्रेट दोनों के लिए बहुत कम जोखिम है और कोई पैराफॉर्मेल्डिहाइड और पिक्रिक एसिड का उपयोग नहीं किया जाता है। इसके अलावा, हालांकि गैबोट और सोमोगी5 विधि के संशोधनों का उपयोग करके गर्भवती कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है, अक्सर वर्गों को निर्जलीकरण चरण के दौरान स्लाइड से अधिक या कम उजागर या गिर गया था और आम तौर पर, विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए कई प्रयोगों को पूल किया जाना था।
वर्तमान प्रोटोकॉल गोल्गी स्टेनिंग किट के उपयोग का वर्णन करता है (सामग्री की तालिका देखें) हिप्पोकैम्पस में डेंड्राइट्स और डेंड्राइटिक स्पाइन्स को लेबल करने के लिए और चूहे के औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी)। पिछले लोगों पर इस विधि के फायदे यह हैं कि यह तेजी से है, शोधकर्ता के लिए हानिकारक रसायनों के लिए कम जोखिम है और न्यूरॉन्स का लगातार धुंधला है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई अध्ययनों में चूहे के हिप्पोकैम्पस और एमपीएफसी में डेंड्रिटिक स्पाइन घनत्व का आकलन करने के लिए मामूली संशोधनों के साथ किया गयाहै 9,10,11,12,13,14,15।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल गोल्गी गर्भाधान की एक विधि का वर्णन करता है जो कई वर्गों के तेजी से एक साथ प्रसंस्करण की अनुमति देता है। यह पहलेसे वर्णित 5 अधिक श्रम-गहन तरीकों पर एक सुधार है और लगातार विश्ल?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सेक्रेड हार्ट यूनिवर्सिटी अंडरग्रेजुएट रिसर्च इनिशिएटिवग्रेंट्स द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
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