Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal

Summary

O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.

Abstract

A impregnação de Golgi, utilizando o kit de coloração golgi com pequenas adaptações, é usada para impregnar espinhas dendríticas no hipocampo de ratos e córtex pré-frontal medial. Esta técnica é uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores de impregnação de Golgi porque os produtos químicos pré-selecionados são mais seguros de usar, os neurônios são consistentemente bem impregnados, há muito menos detritos de fundo, e para uma determinada região, há desvios extremamente pequenos na densidade da coluna vertebral entre experimentos. Além disso, os cérebros podem ser acumulados após um certo ponto e mantidos congelados até um processamento mais aprofundado. Usando este método qualquer região de interesse cerebral pode ser estudada. Uma vez manchada e coberta escorregada, a densidade da coluna vertebral dendrítica é determinada contando o número de espinhas para um comprimento de dendrito e expressa como densidade da coluna vertebral por dendrito de 10 μm.

Introduction

O método de uso de dicromato de potássio e nitrato de prata para rotular neurônios foi descrito pela primeira vez por Camillo Golgi ^1,2 e posteriormente usado por Santiago Ramon y Cajal para produzir um imenso corpo de trabalho diferenciando subtipos neuronais e gliais. Um livro recentemente publicado com suas ilustrações está agora disponível³. Após os estudos de Ramon e Cajal, publicados há mais de 100 anos, pouco golgi impregnação foi utilizada. A impregnação de Golgi é um processo trabalhoso que permite a visualização tridimensional de neurônios com um microscópio leve. Houve inúmeras modificações do método Golgi ao longo dos anos para facilitar o método e a coloração mais consistente⁴. Em 1984, Gabbott e Somogyi⁵ descreveram o procedimento de impregnação da seção única golgi que permitiu um processamento mais rápido. Este método de impregnação golgi requer perfusão com 4% de paraformaldeído e 1,5% de ácido picrico, pós-fixação seguida de vibratome seção em um banho de 3% de dicroma de potássio. As seções são montadas em lâminas de vidro, os quatro cantos de tampas colados de modo que, quando imersos em nitrato de prata, a difusão é gradual. As manchas são então retiradas, as seções são desidratadas e, eventualmente, cobrem o deslizamento permanentemente com o meio de montagem. Esta técnica foi usada com sucesso para rotular neurônios e glia ^6,7,8 no hipocampo. O método golgi rápido descrito aqui é uma melhoria porque há muito menos exposição tanto ao dicromato de potássio quanto ao nitrato de prata e não são utilizados paraformaldeído e ácido picrico. Além disso, embora as células que foram impregnadas usando modificações do método Gabbott e Somogyi⁵ pudessem ser analisadas, muitas vezes as seções estavam sobreexe ou sub-expostas ou caíram dos slides durante a etapa de desidratação e, geralmente, vários experimentos tinham que ser agrupados para ter células suficientes para análise.

O presente protocolo descreve o uso do kit de coloração golgi (ver Tabela de materiais) para rotular dendritos e colunas dendríticas no hipocampo e córtex pré-frontal medial (mPFC) do rato. As vantagens desse método em relação aos anteriores são que ele é rápido, há menos exposição a produtos químicos nocivos para o pesquisador e há uma coloração consistente de neurônios. O protocolo descrito abaixo tem sido usado com pequenas modificações para avaliar a densidade da coluna vertebral dendrítica no hipocampo e mPFC do rato em muitos estudos 9,10,11,12,13,14,15.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Coração Sagrado e estão de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais. 1. Isolamento e infiltração do tecido cerebral Soluções Pré-x A e B do kit de coloração Golgi 24 horas antes de usar e manter em garrafas escuras e/ou no escuro. Faça aproximadamente 80 mL de mistura de solução A e B que é suficiente para mudar …

Representative Results

Usando o método Golgi rápido, as células são consistentemente bem impregnadas para que haja muitas células para analisar. Trata-se de uma melhoria acentuada em relação aos métodos anteriores, onde os experimentos tiveram que ser agrupados para ter dados suficientes para análise. Portanto, mais amostras podem ser processadas de uma só vez e cérebros podem ser armazenados congelados até o processamento. Exemplos de células impregnadas de Golgi na região ca1 do hipocampo são mostrados em baixa e alta potênci…

Discussion

O presente protocolo descreve um método de impregnação de Golgi que permite o processamento simultâneo rápido de muitas seções. É uma melhoria em relação aos⁵ métodos mais intensivos em mão-de-obra e produz consistentemente neurônios impregnados para análise. Além disso, há menos exposição a produtos químicos tóxicos usados na impregnação de Golgi. A parte mais desafiadora do processo é fazer com que as seções sejam planas nos slides, o que requer uma prática consideráve…

Materials

Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck