Snabb Golgi-fläck för dendritisk ryggradsvisualisering i Hippocampus och Prefrontal Cortex

Summary

Protokollet beskriver en modifiering av den snabba Golgi-metoden, som kan anpassas till någon del av nervsystemet, för färgning av neuroner i hippocampus och medial prefrontal cortex hos råttan.

Abstract

Golgi-impregnering, med användning av Golgi-färgningssatsen med mindre anpassningar, används för att impregnera dendritiska spines i råtta hippocampus och medial prefrontal cortex. Denna teknik är en markant förbättring jämfört med tidigare metoder för Golgi-impregnering eftersom de förblandade kemikalierna är säkrare att använda, neuroner är konsekvent väl impregnerade, det finns mycket mindre bakgrundsskräp och för en given region finns det extremt små avvikelser i ryggradstätheten mellan experimenten. Dessutom kan hjärnor ackumuleras efter en viss punkt och hållas frysta tills vidare bearbetning. Med hjälp av denna metod kan någon hjärnregion av intresse studeras. När den väl har färgats och locket glidit bestäms dendritisk ryggradstäthet genom att räkna antalet spines för en längd av dendrit och uttryckas som ryggradstäthet per 10 μm dendrit.

Introduction

Metoden att använda kaliumdikromat och silvernitrat för att märka neuroner beskrevs först av Camillo Golgi ^1,2 och användes därefter av Santiago Ramon y Cajal för att producera en enorm mängd arbete som skiljer neuronala och gliala subtyper. En nyligen publicerad bok med hans illustrationer finns nu tillgänglig³. Efter Ramon y Cajals studier, som publicerades för mer än 100 år sedan, användes mycket lite Golgi-impregnering. Golgi-impregnering är en mödosam process som möjliggör tredimensionell visualisering av neuroner med ett ljusmikroskop. Det har skett många modifieringar av Golgi-metoden genom åren för att göra metoden enklare och färgningen mer konsekvent⁴. År 1984 beskrev Gabbott och Somogyi⁵ det enda sektionen Golgi-impregneringsförfarandet som möjliggjorde snabbare bearbetning. Denna Golgi-impregneringsmetod kräver perfusion med 4% paraformaldehyd och 1,5% pikrinsyra, efterfixering följt av vibratomsektion i ett bad av 3% kaliumdikromat. Sektioner monteras på glasrutschbanor, de fyra hörnen av täckglas limmade så att diffusionen gradvis är nedsänkt i silvernitrat. Täckglas poppas sedan av, sektionerna är uttorkade och så småningom glider locket permanent med monteringsmedium. Denna teknik användes framgångsrikt för att märka neuroner och glia ^6,7,8 i hippocampus. Den snabba Golgi-metoden som beskrivs här är en förbättring eftersom det finns mycket mindre exponering för både kaliumdikromat och silvernitrat och ingen paraformaldehyd och pikrinsyra används. Dessutom, även om celler som impregnerades med hjälp av modifieringar av Gabbott- och Somogyi^5-metoden kunde analyseras, var sektionerna ofta över- eller underexponerade eller föll av bilderna under uttorkningssteget och i allmänhet måste flera experiment samlas för att ha tillräckligt med celler för analys.

Det föreliggande protokollet beskriver användningen av Golgi-färgningssatsen (se Materialtabell) för att märka dendriter och dendritiska spines i hippocampus och medial prefrontal cortex (mPFC) hos råttan. Fördelarna med denna metod jämfört med tidigare är att den är snabb, det finns mindre exponering för skadliga kemikalier för forskaren och det finns konsekvent färgning av neuroner. Protokollet som beskrivs nedan har använts med mindre modifieringar för att bedöma dendritisk ryggradstäthet i hippocampus och mPFC hos råtta i många studier 9,10,11,12,13,14,15.

Protocol

Alla experimentella förfaranden är godkända av Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee och är i enlighet med NIH Guide for the Care and Use of Animals. 1. Isolering och infiltration av hjärnvävnad Förblandningslösningar A och B i Golgi-färgningssatsen 24 timmar före användning och förvara i mörka flaskor och / eller i mörker. Gör cirka 80 ml lösning A- och B-blandning som är tillräcklig för att byta lösning efter 24 tim…

Representative Results

Med hjälp av den snabba Golgi-metoden impregneras cellerna konsekvent väl så att det finns gott om celler att analysera. Detta är en markant förbättring jämfört med tidigare metoder där experiment måste slås samman för att ha tillräckligt med data för analys. Därför kan fler prover bearbetas på en gång och hjärnor kan lagras frysta tills bearbetning. Exempel på Golgi-impregnerade celler i CA1-regionen i hippocampus visas vid låg och hög effekt i figur 3. Räkning av spi…

Discussion

Det föreliggande protokollet beskriver en metod för Golgi-impregnering som möjliggör snabb samtidig bearbetning av många sektioner. Det är en förbättring jämfört med tidigare beskrivna⁵ mer arbetsintensiva metoder och ger konsekvent impregnerade neuroner för analys. Dessutom finns det mindre exponering för giftiga kemikalier som används vid Golgi-impregnering. Den mest utmanande delen av processen är att få sektionerna att vara platta på bilderna, vilket kräver stor övning. Att h…

Materials

Cardboard slides trays	Fisher Scientific	12-587-10
Coverslips 24 x 60mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain kit	FD Neurotechnologies	PK 401	Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit
Freezing Spray	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	clearing agent
NCSS Software	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	mounting medium
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65	Used to mount brains on cryostat chuck