Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi
Summary
Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.
Abstract
Golgi emprenyesi, küçük adaptasyonlarla Golgi boyama kitini kullanarak, sıçan hipokampüsü ve medial prefrontal korteksteki dendritik dikenleri emprenye etmek için kullanılır. Bu teknik, önceki Golgi emprenye yöntemlerine göre belirgin bir gelişmedir, çünkü önceden karıştırılmış kimyasalların kullanımı daha güvenlidir, nöronlar sürekli olarak iyi emprenye edilir, çok daha az arka plan enkazı vardır ve belirli bir bölge için, deneyler arasında omurga yoğunluğunda son derece küçük sapmalar vardır. Dahası, beyinler belirli bir noktadan sonra biriktirilebilir ve bir sonraki işleme kadar dondurulmuş halde tutulabilir. Bu yöntemi kullanarak, ilgilenilen herhangi bir beyin bölgesi incelenebilir. Lekelendikten ve örtü kaydıktan sonra, dendritik omurga yoğunluğu, bir dendrit uzunluğu için diken sayısının sayılmasıyla belirlenir ve 10 μm dendrit başına omurga yoğunluğu olarak ifade edilir.
Introduction
Nöronları etiketlemek için potasyum dikromat ve gümüş nitrat kullanma yöntemi ilk olarak Camillo Golgi 1,2 tarafından tanımlanmış ve daha sonra Santiago Ramon y Cajal tarafından nöronal ve glial alt tipleri farklılaştıran muazzam bir çalışma gövdesi üretmek için kullanılmıştır. İllüstrasyonlarıyla yakın zamanda yayınlanmış bir kitap şimdi mevcuttur3. Ramon y Cajal’ın 100 yıldan daha uzun bir süre önce yayınlanan çalışmalarını takiben, çok az Golgi emprenye kullanıldı. Golgi emprenyesi, nöronların ışık mikroskobu ile üç boyutlu olarak görselleştirilmesini sağlayan zahmetli bir süreçtir. Yöntemi daha kolay ve boyama işlemini daha tutarlı hale getirmek için yıllar içinde Golgi yönteminde çok sayıda değişiklikyapılmıştır 4. 1984 yılında Gabbott ve Somogyi5, daha hızlı işlemeye izin veren tek bölümlü Golgi emprenye prosedürünü tanımladı. Bu Golgi emprenye yöntemi,% 4 paraformaldehit ve% 1.5 pikrik asit ile perfüzyon, fiksasyon sonrası,% 3 potasyum dikromat banyosuna vibratom kesiti gerektirir. Bölümler cam slaytlara monte edilir, kapakların dört köşesi yapıştırılır, böylece gümüş nitrata daldırıldığında difüzyon kademeli olur. Kapaklar daha sonra atılır, bölümler kurutulur ve sonunda kapak montaj ortamı ile kalıcı olarak kaydırılır. Bu teknik, hipokampustaki nöronları ve glia 6,7,8’i etiketlemek için başarıyla kullanıldı. Burada açıklanan hızlı Golgi yöntemi bir gelişmedir, çünkü hem potasyum dikromat hem de gümüş nitrata çok daha az maruz kalınır ve paraformaldehit ve pikrik asit kullanılmaz. Ek olarak, Gabbott ve Somogyi5 yönteminin modifikasyonları kullanılarak emprenye edilen hücreler analiz edilebilse de, çoğu zaman bölümler dehidrasyon adımı sırasında slaytlardan aşırı veya az maruz kaldı veya düştü ve genel olarak, analiz için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç deneyin bir araya getirilmesi gerekiyordu.
Mevcut protokol, hipokampustaki dendritleri ve dendritik dikenleri etiketlemek için Golgi boyama kitinin (bkz. malzeme tablosu) ve sıçanın medial prefrontal korteksinin (mPFC) kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntemin öncekilere göre avantajları, hızlı olması, araştırmacı için zararlı kimyasallara daha az maruz kalması ve nöronların tutarlı bir şekilde boyanmasıdır. Aşağıda açıklanan protokol, 9,10,11,12,13,14,15 sayılı çalışmada sıçanın hipokampüsündeki ve mPFC’sindeki dendritik omurga yoğunluğunu değerlendirmek için küçük modifikasyonlarla kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, birçok bölümün hızlı bir şekilde eşzamanlı olarak işlenmesini sağlayan bir Golgi emprenye yöntemini açıklamaktadır. Daha önce tarif edilen5 daha fazla emek yoğun yönteme göre bir gelişmedir ve analiz için sürekli olarak emprenye edilmiş nöronlar verir. Ek olarak, Golgi emprenyesinde kullanılan toksik kimyasallara daha az maruz kalınır. Sürecin en zorlu kısmı, bölümlerin slaytlarda düz olmasını sağlamaktır, bu da önemli bir uygulama gerektirir….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sacred Heart Üniversitesi Lisans Araştırma GirişimiGrants tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
Referências
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
