ממברנת שליו כוריואלנטואית - כלי לאבחון וטיפול פוטודינמי
Summary
הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר העופות היא כלי שימושי מאוד וישים לתחומי מחקר שונים. דגם אקס אובו מיוחד של שליו יפני CAM מתאים לחקירת טיפול פוטודינמי.
Abstract
הממברנה הכוריאלנטואית (CAM) של עובר עופות היא קרום דק, חוץ-עובריוני, המתפקד כאיבר נשימה ראשוני. תכונותיו הופכות אותו למודל ניסויי מצוין של in vivo לחקר אנגיוגנזה, גידול גידולים, מערכות אספקת תרופות או אבחון פוטודינמי (PDD) וטיפול פוטודינמי (PDT). יחד עם זאת, מודל זה נותן מענה לדרישה להחלפת חיות הניסוי בחלופה מתאימה. עובר מעובד לשעבר מאפשר יישום חומרים קלים, גישה, ניטור ותיעוד. הנפוץ ביותר הוא צ’יק CAM; עם זאת, מאמר זה מתאר את היתרונות של CAM שליו יפני כמודל בעלות נמוכה ותפוקה גבוהה. יתרון נוסף הוא ההתפתחות העוברית הקצרה יותר, המאפשרת תחלופה ניסיונית גבוהה יותר. ההתאמה של CAM שליו עבור PDD ו- PDT של סרטן וזיהומים מיקרוביאליים נחקרת כאן. כדוגמה, מתואר השימוש בהיפריצין פוטוסנסיטייזר בשילוב עם ליפופרוטאינים או ננו-חלקיקים כמערכת משלוח. נקבע ציון הנזק מתמונות באור לבן ושינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של רקמת CAM תחת אור סגול (405 ננומטר), יחד עם ניתוח של קטעים היסטולוגיים. CAM שליו הראה בבירור את ההשפעה של PDT על כלי הדם והרקמות. יתר על כן, ניתן היה לראות שינויים כמו דימום נימי, פקקת, תזה של כלי דם קטנים ודימום של כלי דם גדולים יותר. שליו יפני CAM הוא מודל מבטיח in vivo לאבחון פוטודינמי ומחקר טיפול, עם יישומים במחקרים של אנגיוגנזה של גידול, כמו גם טיפול אנטי-וסקולרי ואנטי-מיקרוביאלי.
Introduction
מודל קרום העוף הכוריאלנטואי (CAM) ידוע ונמצא בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים. זהו איבר אקסטרה-אמבריוני עשיר בכלי הדם המספק חילופי גזים והובלת מינרלים1. בשל השקיפות והנגישות של קרום זה, כלי דם בודדים ושינויים מבניים שלהם ניתן לראות בזמן אמת2. למרות היתרונות, ל-Chick CAM יש גם כמה מגבלות (למשל, מתקני רבייה גדולים יותר, ייצור ביצים וצריכת מזון) שניתן להימנע מהן על ידי שימוש במיני עופות אחרים. בפרוטוקול זה מתואר מודל ex ovo CAM חלופי המשתמש בעובר שליו יפני (Coturnix japonica). בשל גודלו הקטן, הוא מאפשר שימוש במספר גדול בהרבה של אנשים ניסיוניים מאשר עוף CAM. יתר על כן, ההתפתחות העוברית הקצרה יותר של 16 יום של עוברי שליו היא יתרון נוסף. הכלים הגדולים הראשונים על שליו CAM מופיעים ביום עוברי (ED) 7. ניתן להשוות זאת ישירות להתפתחות עובר אפרוח (שלבים 4-35); עם זאת, השלבים המאוחרים יותר של ההתפתחות כבר אינם ברי השוואה ודורשים פחות זמן עבור עובר שליו3. מעניין הוא המופע הרגיל של הסתעפות כלי דם דומה לזה של עוף CAMs 4,5,6. התבגרות מינית מהירה, ייצור ביצים גבוה וגידול בעלות נמוכה הן דוגמאות אחרות המעדיפות את השימוש במודל ניסיוניזה 7.
מודל CAM של עופות משמש לעתים קרובות במחקרי טיפול פוטודינמי (PDT)8. PDT משמש לטיפול במספר צורות של סרטן (גידולים מקומיים קטנים) ומחלות לא אונקולוגיות אחרות. העיקרון שלה הוא בהעברת תרופה פלואורסצנטית, פוטוסנסיטייזר (PS), לרקמה הפגועה והפעלתה עם אור באורך הגל המתאים. PS פרוספקטיבי אחד המשמש במחקר הוא היפריצין, שבודד במקור מצמח המרפא וורט סנט ג’ון (Hypericum perforatum)9. ההשפעות החזקות של רגישות לאור של תרכובת זו מבוססות על תכונותיה הפוטוכימיות והפוטופיזיקליות. אלה מאופיינים במספר פסגות עירור פלואורסצנטיות בטווח של 400-600 ננומטר, הגורמות לפליטת פלואורסצנציה בכ-600 ננומטר. מקסימום הקליטה של היפריצין בתוך הפס הספקטרלי נמצא בתחום 540-590 ננומטר, ומקסימה פלואורסצנטית נמצאת בטווח 590-640 ננומטר9. כדי להשיג את ההשפעות האלה של רגישות לאור, היפריצין מתרגש מאור לייזר באורך גל של 405 ננומטר לאחר מתןמקומי 10. בנוכחות אור, hypericin יכול להפגין השפעות וירוסידליות, antiproliferative, ו cytotoxic11, בעוד אין רעילות מערכתית, והוא משתחרר במהירות מן האורגניזם. היפריצין הוא חומר ליפופילי היוצר אגרגטים בלתי מסיסים במים, שאינם פלואורסצנטיים, ולכן מספר סוגים של ננו-נשארים, כגון ננו-חלקיקים פולימריים 12,13 או ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה ונמוכה (HDL, LDL)14,15, משמשים כדי לסייע בהעברתו ובחדירתו לתאים. מכיוון ש-CAM היא מערכת חיסונית טבעית, ניתן להשתיל תאי גידול ישירות על פני הממברנה. המודל מתאים גם לרישום היקף הנזק הנגרם לכלי דם כתוצאה מ-PDT על פי ציוןמוגדר 16,17. אור בעוצמה נמוכה יותר בהשוואה ל-PDT יכול לשמש לאבחון פוטודינמי (PDD). ניטור הרקמה תחת עירור סגול נורית LED מוביל גם לפוטואקטיבציה של פוטו-סנסיטייזרים18,19,20 שמביאה לפליטת אור פלואורסצנטי, אך היא אינה מספקת מספיק אנרגיה כדי להתחיל תגובת PDT ולפגוע בתאים. זה עושה את זה כלי טוב עבור הדמיה של הגידול ואבחון או ניטור הפרמקוקינטיקה של PSsמשומש 14,15.
מאמר זה מתאר את ההכנה של שליו ex ovo CAM מבחן עם שיעורי הישרדות מעל 80%. תרבות אובו לשעבר זו יושמה בהצלחה במספר רב של ניסויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לטיפוח מוצלח של ex ovo , חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול לעיל. יתר על כן, אם הביצים לא נפתחות בזהירות מספקת או שאין לחות מספקת במהלך הטיפוח, שק החלמון נדבק לקליפה ולעתים קרובות נקרע. תחילתו של גידול אובו לשעבר בזמן של כ -60 שעות של דגירה ביצה מבטיחה את שיעור ההישרדות הגבוה של העוברים, שכן הם כב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי VEGA 2/0042/21 ו- APVV 20-0129. תרומתו של V. Huntošová היא תוצאה של יישום הפרויקט: קהילה מדעית פתוחה למחקר בינתחומי מודרני ברפואה (ראשי תיבות: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 הנתמכת על ידי התשתית המשולבת של התוכנית התפעולית, במימון ERDF.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
Referências
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
