Den chorioallantoiske membran (CAM) i fugleembryoet er et meget nyttigt og anvendeligt værktøj til forskellige forskningsområder. En særlig ex ovo-model af japansk vagtel CAM er velegnet til fotodynamisk behandlingsundersøgelse.
Den chorioallantoiske membran (CAM) i et fugleembryo er en tynd, ekstraembryonal membran, der fungerer som et primært åndedrætsorgan. Dens egenskaber gør det til en fremragende in vivo eksperimentel model til at studere angiogenese, tumorvækst, lægemiddelleveringssystemer eller fotodynamisk diagnose (PDD) og fotodynamisk terapi (PDT). Samtidig imødekommer denne model kravet om udskiftning af forsøgsdyr med et passende alternativ. Ex ovo dyrket embryo giver nem stofpåføring, adgang, overvågning og dokumentation. Den mest anvendte er chick CAM; Denne artikel beskriver dog fordelene ved den japanske vagtel CAM som en billig og høj gennemstrømningsmodel. En anden fordel er den kortere embryonale udvikling, hvilket muliggør højere eksperimentel omsætning. Egnetheden af vagtel CAM til PDD og PDT af kræft og mikrobielle infektioner undersøges her. Som et eksempel beskrives brugen af fotosensibilisatoren hypericin i kombination med lipoproteiner eller nanopartikler som et leveringssystem. Skadesscoren fra billeder i hvidt lys og ændringer i fluorescensintensiteten af CAM-vævet under violet lys (405 nm) blev bestemt sammen med analyse af histologiske sektioner. Vagtel CAM viste tydeligt effekten af PDT på vaskulaturen og vævet. Desuden kunne ændringer som kapillærblødning, trombose, lysis af små kar og blødning af større kar observeres. Japansk vagtel CAM er en lovende in vivo-model til fotodynamisk diagnose og terapiforskning med anvendelser i undersøgelser af tumorangiogenese samt antivaskulær og antimikrobiel terapi.
Kylling chorioallantoic membran (CAM) modellen er velkendt og udbredt inden for forskellige forskningsområder. Det er et rigt vaskulariseret ekstraembryonalt organ, der giver gasudveksling og mineraltransport1. På grund af gennemsigtigheden og tilgængeligheden af denne membran kan individuelle blodkar og deres strukturelle ændringer observeres i realtid2. På trods af fordelene har kyllinge-CAM også nogle begrænsninger (f.eks. Større avlsfaciliteter, ægproduktion og foderforbrug), der kunne undgås ved at bruge andre fuglearter. I denne protokol beskrives en alternativ ex ovo CAM-model med japansk vagtel (Coturnix japonica) embryo. På grund af sin lille størrelse tillader det brugen af et meget større antal eksperimentelle individer end kylling CAM. Desuden er den kortere 16-dages embryonale udvikling af vagtelembryoner en anden fordel. De første større fartøjer på vagtel CAM vises på embryonal dag (ED) 7. Dette kan sammenlignes direkte med chick embryo udvikling (trin 4-35); De senere udviklingsstadier er imidlertid ikke længere sammenlignelige og kræver mindre tid til vagtelembryoet3. Af interesse er den regelmæssige forekomst af mikrovaskulær forgrening svarende til kylling CAMs 4,5,6. Hurtig seksuel modning, høj ægproduktion og billig avl er andre eksempler, der favoriserer brugen af denne eksperimentelle model7.
En CAM-model anvendes ofte i fotodynamiske terapiundersøgelser (PDT)8. PDT bruges til behandling af flere former for kræft (små lokaliserede tumorer) og andre ikke-onkologiske sygdomme. Dets princip er i levering af et fluorescerende lægemiddel, en fotosensibilisator (PS), til det beskadigede væv og dets aktivering med lys med den passende bølgelængde. En potentiel PS, der anvendes i forskning, er hypericin, oprindeligt isoleret fra lægeplanten St. John’s wort (Hypericum perforatum)9. De stærke fotosensibiliserende virkninger af denne forbindelse er baseret på dets fotokemiske og fotofysiske egenskaber. Disse er kendetegnet ved flere fluorescens excitation toppe i området 400-600 nm, hvilket inducerer emission af fluorescens ved ca. 600 nm. Absorptionsmaksima for hypericin inden for spektralbåndet ligger i området 540-590 nm, og fluorescensmaksima ligger i området 590-640 nm9. For at opnå disse fotosensibiliserende effekter ophidses hypericin af laserlys ved en bølgelængde på 405 nm efter lokal administration10. I nærvær af lys kan hypericin udvise virucide, antiproliferative og cytotoksiske virkninger11, mens der ikke er nogen systemisk toksicitet, og det frigives hurtigt fra organismen. Hypericin er et lipofilt stof, der danner vanduopløselige, ikke-fluorescerende aggregater, hvorfor flere typer nanocarriers, såsom polymere nanopartikler 12,13 eller lipoproteiner med høj og lav densitet (HDL, LDL)14,15, bruges til at hjælpe dets levering og indtrængning i cellerne. Da CAM er et naturligt immundefekt system, kan tumorceller implanteres direkte på membranoverfladen. Modellen er også velegnet til registrering af omfanget af PDT-induceret vaskulær skade i henhold til en defineret score16,17. Lys med lavere intensitet sammenlignet med PDT kan bruges til fotodynamisk diagnose (PDD). Overvågning af vævet under violet excitation LED-lys fører også til fotoaktivering af fotosensibilisatorer18,19,20, der resulterer i en emission af fluorescerende lys, men det giver ikke nok energi til at starte en PDT-reaktion og beskadige cellerne. Det gør det til et godt værktøj til tumorvisualisering og diagnose eller overvågning af farmakokinetikken af brugte PSs14,15.
Denne artikel beskriver forberedelsen af vagtler ex ovo CAM-assay med overlevelsesrater over 80%. Denne ex ovo-kultur blev anvendt med succes i et stort antal eksperimenter.
For en vellykket ex ovo-dyrkning er det vigtigt at følge protokollen ovenfor. Desuden, hvis æggene ikke åbnes omhyggeligt nok, eller der ikke er tilstrækkelig fugtighed under dyrkningen, klæber æggeblommesækken til skallen og brister ofte. Påbegyndelsen af en ex ovo-dyrkning på tidspunktet for ca. 60 timers æginkubation sikrer embryonernes høje overlevelsesrate, da de allerede er store nok til at overleve håndteringen. På de senere udviklingsstadier bliver CAM tyndere og klæber til æggesk…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af VEGA 2/0042/21 og APVV 20-0129. V. Huntošovás bidrag er resultatet af projektgennemførelsen: Åbent videnskabeligt fællesskab for moderne tværfaglig forskning inden for medicin (akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 støttet af det operationelle programs integrerede infrastruktur, finansieret af EFRU.
6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
incubator Bios Midi | Bios Sedlany, Czech Republic | Forced draught incubator for initial incubation | |
incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |