Kwartel Chorioallantoic Membrane - Een hulpmiddel voor fotodynamische diagnose en therapie
Summary
Het chorioallantoic membrane (CAM) van het aviaire embryo is een zeer nuttig en toepasbaar hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. Een speciaal ex ovo model van Japanse kwartel CAM is geschikt voor fotodynamisch behandelonderzoek.
Abstract
Het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo is een dun, extra-embryonaal membraan dat functioneert als een primair ademhalingsorgaan. De eigenschappen maken het een uitstekend in vivo experimenteel model om angiogenese, tumorgroei, medicijnafgiftesystemen of fotodynamische diagnose (PDD) en fotodynamische therapie (PDT) te bestuderen. Tegelijkertijd gaat dit model in op de eis van vervanging van proefdieren door een geschikt alternatief. Ex ovo gekweekt embryo maakt eenvoudige toepassing van stoffen, toegang, monitoring en documentatie mogelijk. De meest gebruikte is chick CAM; dit artikel beschrijft echter de voordelen van de Japanse kwartel CAM als een low-cost en high-throughput model. Een ander voordeel is de kortere embryonale ontwikkeling, die een hogere experimentele omzet mogelijk maakt. De geschiktheid van kwartel CAM voor PDD en PDT van kanker en microbiële infecties wordt hier onderzocht. Als voorbeeld wordt het gebruik van de photosensitizer hypericine in combinatie met lipoproteïnen of nanodeeltjes als toedieningssysteem beschreven. De schadescore van beelden in wit licht en veranderingen in fluorescentie-intensiteit van het CAM-weefsel onder violet licht (405 nm) werd bepaald, samen met analyse van histologische secties. De kwartel CAM toonde duidelijk het effect van PDT op de vasculatuur en het weefsel. Bovendien konden veranderingen zoals capillaire bloeding, trombose, lysis van kleine bloedvaten en bloedingen van grotere bloedvaten worden waargenomen. Japanse kwartel CAM is een veelbelovend in vivo model voor fotodynamische diagnose en therapieonderzoek, met toepassingen in studies van tumorangiogenese, evenals antivasculaire en antimicrobiële therapie.
Introduction
Het kip chorioallantoic membrane (CAM) model is bekend en wordt veel gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden. Het is een rijkelijk gevasculariseerd extra-embryonaal orgaan dat zorgt voor gasuitwisseling en mineraaltransport1. Door de transparantie en toegankelijkheid van dit membraan kunnen individuele bloedvaten en hun structurele veranderingen in realtime worden waargenomen2. Ondanks de voordelen heeft kuiken CAM ook enkele beperkingen (bijv. Grotere fokfaciliteiten, eierproductie en voerconsumptie) die kunnen worden vermeden door andere vogelsoorten te gebruiken. In dit protocol wordt een alternatief ex ovo CAM-model beschreven met Japans kwartel (Coturnix japonica) embryo. Vanwege zijn kleine formaat maakt het het gebruik van een veel groter aantal experimentele individuen mogelijk dan kip CAM. Bovendien is de kortere 16-daagse embryonale ontwikkeling van kwartembryo’s een ander voordeel. De eerste grotere vaten op kwartel CAM verschijnen op embryonale dag (ED) 7. Dit kan direct worden vergeleken met de ontwikkeling van kuikenembryo’s (stadia 4-35); de latere ontwikkelingsstadia zijn echter niet meer vergelijkbaar en vergen minder tijd voor het kwartembryo3. Van belang is het regelmatig voorkomen van microvasculaire vertakkingen vergelijkbaar met die van kip CAMs 4,5,6. Snelle seksuele rijping, hoge eiproductie en goedkope fokkerij zijn andere voorbeelden die het gebruik van dit experimentele model7 bevorderen.
Een aviair CAM-model wordt vaak gebruikt in fotodynamische therapie (PDT) studies8. PDT wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende vormen van kanker (kleine gelokaliseerde tumoren) en andere niet-oncologische ziekten. Het principe is in de afgifte van een fluorescerend medicijn, een fotosensitizer (PS), aan het beschadigde weefsel en de activering ervan met licht van de juiste golflengte. Een prospectieve PS die in onderzoek wordt gebruikt, is hypericine, oorspronkelijk geïsoleerd uit de medicinale plant Sint-janskruid (Hypericum perforatum)9. De sterke fotosensibiliserende effecten van deze verbinding zijn gebaseerd op de fotochemische en fotofysische eigenschappen. Deze worden gekenmerkt door meerdere fluorescentie-excitatiepieken in het bereik van 400-600 nm, die de emissie van fluorescentie bij ongeveer 600 nm induceren. De absorptiemaxima van hypericine binnen de spectrale band liggen in het bereik van 540-590 nm en de fluorescentiemaxima liggen in het 590-640 nm-bereik9. Om deze fotosensibiliserende effecten te bereiken, wordt hypericine geëxciteerd door laserlicht op een golflengte van 405 nm na lokale toediening10. In aanwezigheid van licht kan hypericine virucide, antiproliferatieve en cytotoxische effecten vertonen11, terwijl er geen systemische toxiciteit is en het snel uit het organisme wordt vrijgegeven. Hypericine is een lipofiele stof die in water onoplosbare, niet-fluorescerende aggregaten vormt, daarom worden verschillende soorten nanodragers, zoals polymere nanodeeltjes12,13 of lipoproteïnen met hoge en lage dichtheid (HDL, LDL)14,15, gebruikt om de afgifte en penetratie ervan in de cellen te helpen. Omdat CAM van nature een immunodeficiënt systeem is, kunnen tumorcellen direct op het membraanoppervlak worden geïmplanteerd. Het model is ook zeer geschikt voor het registreren van de omvang van PDT-geïnduceerde vasculaire schade volgens een gedefinieerde score16,17. Licht met een lagere intensiteit in vergelijking met PDT kan worden gebruikt voor fotodynamische diagnose (PDD). Het monitoren van het weefsel onder violet excitatie LED-licht leidt ook tot fotoactivering van fotosensitizers 18,19,20 die resulteert in een emissie van fluorescerend licht, maar het levert niet genoeg energie om een PDT-reactie te starten en de cellen te beschadigen. Het maakt het een goed hulpmiddel voor tumorvisualisatie en -diagnose of het monitoren van de farmacokinetiek van gebruikte PS’en14,15.
Dit artikel beschrijft de bereiding van de kwartel ex ovo CAM-test met overlevingspercentages van meer dan 80%. Deze ex ovo-cultuur werd met succes toegepast in een groot aantal experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor succesvolle ex ovo teelt is het belangrijk om het bovenstaande protocol te volgen. Bovendien, als de eieren niet voorzichtig genoeg worden geopend of als er onvoldoende vochtigheid is tijdens de teelt, kleeft de dooierzak aan de schaal en scheurt vaak. De start van een ex ovo-teelt op het moment van ongeveer 60 uur ei-incubatie zorgt voor de hoge overlevingskans van de embryo’s, omdat ze al groot genoeg zijn om de behandeling te overleven. In de latere ontwikkelingsstadia wordt de CAM dunner en hec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door VEGA 2/0042/21 en APVV 20-0129. De bijdrage van V. Huntošová is het resultaat van de projectimplementatie: Open wetenschappelijke gemeenschap voor modern interdisciplinair onderzoek in de geneeskunde (Acroniem: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 ondersteund door het Operational Program Integrated Infrastructure, gefinancierd door het EFRO.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
Referências
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
