Quail Chorioallantoic Membrane - ett verktyg för fotodynamisk diagnos och terapi
Summary
Det korioallantoiska membranet (CAM) hos det aviära embryot är ett mycket användbart och tillämpligt verktyg för olika forskningsområden. En speciell ex ovo-modell av japansk vaktel CAM är lämplig för fotodynamisk behandlingsundersökning.
Abstract
Det korioallantoiska membranet (CAM) hos ett fågelembryo är ett tunt, extraembryoniskt membran som fungerar som ett primärt andningsorgan. Dess egenskaper gör det till en utmärkt in vivo experimentell modell för att studera angiogenes, tumörtillväxt, läkemedelsleveranssystem eller fotodynamisk diagnos (PDD) och fotodynamisk terapi (PDT). Samtidigt tillgodoser denna modell kravet på att försöksdjur ersätts med ett lämpligt alternativ. Ex ovo odlat embryo möjliggör enkel substansapplikation, åtkomst, övervakning och dokumentation. Den mest använda är chick CAM; Denna artikel beskriver dock fördelarna med den japanska vaktel-CAM som en billig och hög genomströmningsmodell. En annan fördel är den kortare embryonala utvecklingen, vilket möjliggör högre experimentell omsättning. Lämpligheten av vaktel CAM för PDD och PDT för cancer och mikrobiella infektioner undersöks här. Som ett exempel beskrivs användningen av fotosensibiliseraren hypericin i kombination med lipoproteiner eller nanopartiklar som ett leveranssystem. Skadepoängen från bilder i vitt ljus och förändringar i fluorescensintensiteten hos CAM-vävnaden under violett ljus (405 nm) bestämdes, tillsammans med analys av histologiska sektioner. Vaktel-CAM visade tydligt effekten av PDT på vaskulaturen och vävnaden. Dessutom kunde förändringar som kapillärblödning, trombos, lys av små kärl och blödning av större kärl observeras. Japansk vaktel CAM är en lovande in vivo-modell för fotodynamisk diagnos och terapiforskning, med tillämpningar i studier av tumörangiogenes samt antivaskulär och antimikrobiell terapi.
Introduction
Kycklingkorioallantoiskt membran (CAM) -modellen är välkänd och används ofta inom olika forskningsområden. Det är ett rikt vaskulärt extraembryoniskt organ som ger gasutbyte och mineraltransport1. På grund av transparensen och tillgängligheten hos detta membran kan enskilda blodkärl och deras strukturella förändringar observeras i realtid2. Trots fördelarna har chick CAM också vissa begränsningar (t.ex. större avelsanläggningar, äggproduktion och foderkonsumtion) som kan undvikas genom att använda andra fågelarter. I detta protokoll beskrivs en alternativ ex ovo CAM-modell med japanskt vaktel (Coturnix japonica) embryo. På grund av sin lilla storlek tillåter den användning av ett mycket större antal experimentella individer än kyckling CAM. Dessutom är den kortare 16-dagars embryonala utvecklingen av vaktelembryon en annan fördel. De första större fartygen på vaktel CAM visas på embryonal dag (ED) 7. Detta kan jämföras direkt med kycklingembryoutveckling (steg 4-35); De senare utvecklingsstadierna är emellertid inte längre jämförbara och kräver mindre tid för vaktelembryot3. Av intresse är den regelbundna förekomsten av mikrovaskulär förgrening som liknar den för kyckling CAMs 4,5,6. Snabb sexuell mognad, hög äggproduktion och lågkostnadsuppfödning är andra exempel som gynnar användningen av denna experimentella modell7.
En aviär CAM-modell används ofta i fotodynamisk terapi (PDT) studier8. PDT används för att behandla flera former av cancer (små lokaliserade tumörer) och andra icke-onkologiska sjukdomar. Dess princip är vid leverans av ett fluorescerande läkemedel, en fotosensibiliserare (PS), till den skadade vävnaden och dess aktivering med ljus med lämplig våglängd. En prospektiv PS som används i forskning är hypericin, ursprungligen isolerad från den medicinska växten Johannesört (Hypericum perforatum)9. De starka fotosensibiliserande effekterna av denna förening är baserade på dess fotokemiska och fotofysiska egenskaper. Dessa kännetecknas av flera fluorescensexcitationstoppar i intervallet 400-600 nm, vilket inducerar utsläpp av fluorescens vid ca 600 nm. Absorptionsmaxima för hypericin inom spektralbandet ligger i intervallet 540-590 nm, och fluorescensmaxima liggeri intervallet 590-640 nm 9. För att uppnå dessa fotosensibiliserande effekter exciteras hypericin av laserljus vid en våglängd på 405 nm efter lokal administration10. I närvaro av ljus kan hypericin uppvisa virucida, antiproliferativa och cytotoxiska effekter11, medan det inte finns någon systemisk toxicitet, och det frigörs snabbt från organismen. Hypericin är en lipofil substans som bildar vattenolösliga, icke-fluorescerande aggregat, varför flera typer av nanobärare, såsom polymera nanopartiklar 12,13 eller lipoproteiner med hög och låg densitet (HDL, LDL)14,15, används för att hjälpa dess leverans och penetration i cellerna. Eftersom CAM är ett naturligt immunbristsystem kan tumörceller implanteras direkt på membranytan. Modellen är också väl lämpad för att registrera omfattningen av PDT-inducerad vaskulär skada enligt en definierad poäng16,17. Ljus med lägre intensitet jämfört med PDT kan användas för fotodynamisk diagnos (PDD). Övervakning av vävnaden under violett excitation LED-ljus leder också till fotoaktivering av fotosensibiliserare18,19,20 som resulterar i en utsläpp av fluorescerande ljus, men det ger inte tillräckligt med energi för att starta en PDT-reaktion och skada cellerna. Det gör det till ett bra verktyg för tumörvisualisering och diagnos eller övervakning av farmakokinetiken för använda PSs14,15.
Denna artikel beskriver beredningen av vaktel ex ovo CAM-analysen med överlevnadsnivåer över 80%. Denna ex ovo-kultur tillämpades framgångsrikt i ett stort antal experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
För framgångsrik ex ovo-odling är det viktigt att följa protokollet ovan. Dessutom, om äggen inte öppnas tillräckligt noggrant eller det inte finns tillräcklig fuktighet under odlingen, fastnar äggula säcken på skalet och brister ofta. Starten av en ex ovo-odling vid tidpunkten för cirka 60 timmars ägginkubation säkerställer embryonas höga överlevnad, eftersom de redan är tillräckligt stora för att överleva hanteringen. Vid de senare utvecklingsstadierna blir CAM tunnare och fäster…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av VEGA 2/0042/21 och APVV 20-0129. V. Huntošovás bidrag är resultatet av projektets genomförande: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 som stöds av det operativa programmet Integrated Infrastructure, finansierat av ERUF.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
Referências
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
