Bıldırcın Korioallantoik Membran - Fotodinamik Tanı ve Tedavi için Bir Araç
Summary
Kuş embriyosunun koryoallantoik membranı (CAM), çeşitli araştırma alanları için çok yararlı ve uygulanabilir bir araçtır. Japon bıldırcın CAM’in özel bir ex ovo modeli, fotodinamik tedavi araştırması için uygundur.
Abstract
Bir kuş embriyosunun koryoalantoik zarı (CAM), birincil solunum organı olarak işlev gören ince, ekstraembriyonik bir zardır. Özellikleri, anjiyogenez, tümör büyümesi, ilaç dağıtım sistemleri veya fotodinamik tanı (PDD) ve fotodinamik tedaviyi (PDT) incelemek için mükemmel bir in vivo deneysel model olmasını sağlar. Aynı zamanda, bu model deney hayvanlarının uygun bir alternatifle değiştirilmesi gerekliliğini de ele almaktadır. Ex ovo ekili embriyo, kolay madde uygulaması, erişimi, izleme ve dokümantasyon sağlar. En sık kullanılan civciv CAM’dir; ancak, bu makalede, Japon bıldırcın CAM’in düşük maliyetli ve yüksek verimli bir model olarak avantajları açıklanmaktadır. Diğer bir avantaj, daha yüksek deneysel ciroya izin veren daha kısa embriyonik gelişmedir. Bıldırcın TAT’ının kanser ve mikrobiyal enfeksiyonların PDD ve PDT’sine uygunluğu burada araştırılmıştır. Örnek olarak, fotosensitizör hiperisinin lipoproteinler veya nanopartiküller ile kombinasyon halinde bir dağıtım sistemi olarak kullanımı açıklanmaktadır. Beyaz ışıktaki görüntülerden kaynaklanan hasar skoru ve mor ışık altında (405 nm) CAM dokusunun floresan yoğunluğundaki değişiklikler, histolojik kesitlerin analizi ile birlikte belirlendi. Bıldırcın TAT PDT’nin vaskülatür ve doku üzerindeki etkisini açıkça göstermiştir. Ayrıca, kılcal kanama, tromboz, küçük damarların lizisi ve daha büyük damarların kanaması gibi değişiklikler gözlenebilir. Japon bıldırcın TAT fotodinamik tanı ve tedavi araştırmaları için umut verici bir in vivo modeldir ve tümör anjiyogenezinin yanı sıra antivasküler ve antimikrobiyal tedavi çalışmalarında da uygulamalar vardır.
Introduction
Tavuk koryoalantoik membran (CAM) modeli iyi bilinmektedir ve çeşitli araştırma alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Gaz değişimi ve mineral taşınımı sağlayan zengin vaskülarize ekstraembriyonik bir organdır1. Bu zarın şeffaflığı ve erişilebilirliği nedeniyle, bireysel kan damarları ve yapısal değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir2. Avantajlarına rağmen, civciv CAM’ın diğer kuş türlerini kullanarak önlenebilecek bazı sınırlamaları (örneğin, daha büyük üreme tesisleri, yumurta üretimi ve yem tüketimi) vardır. Bu protokolde, Japon bıldırcın (Coturnix japonica) embriyosunu kullanan alternatif bir ex ovo CAM modeli tanımlanmıştır. Küçük boyutu nedeniyle, tavuk CAM’den çok daha fazla sayıda deneysel bireyin kullanılmasına izin verir. Ayrıca, bıldırcın embriyolarının 16 günlük embriyonik gelişiminin daha kısa olması başka bir avantajdır. Bıldırcın CAM üzerindeki ilk büyük damarlar embriyonik günde (ED) 7’de ortaya çıkar. Bu doğrudan civciv embriyo gelişimi ile karşılaştırılabilir (aşama 4-35); Bununla birlikte, gelişimin sonraki aşamaları artık karşılaştırılabilir değildir ve bıldırcın embriyosu3 için daha az zaman gerektirir. İlgi çekici olan, tavuk CAM’lerinin 4,5,6’sına benzer mikrovasküler dallanmanın düzenli olarak ortaya çıkmasıdır. Hızlı cinsel olgunlaşma, yüksek yumurta üretimi ve düşük maliyetli üreme, bu deneysel modelin kullanımını destekleyen diğer örneklerdir7.
Bir kuş CAM modeli genellikle fotodinamik terapi (PDT) çalışmalarında kullanılır8. PDT, çeşitli kanser türlerini (küçük lokalize tümörler) ve diğer onkolojik olmayan hastalıkları tedavi etmek için kullanılır. İlkesi, bir floresan ilacın, bir fotosensitizörün (PS) hasarlı dokuya verilmesi ve uygun dalga boyundaki ışıkla aktivasyonudur. Araştırmada kullanılan prospektif PS, başlangıçta tıbbi bitki St. John’s wort’tan (Hypericum perforatum) izole edilen hiperisindir9. Bu bileşiğin güçlü ışığa duyarlı etkileri, fotokimyasal ve fotofiziksel özelliklerine dayanmaktadır. Bunlar, yaklaşık 600 nm’de floresan emisyonunu indükleyen 400-600 nm aralığında çoklu floresan uyarma zirveleri ile karakterize edilir. Spektral bant içindeki hiperisin absorpsiyon maksimumu 540-590 nm aralığındadır ve floresan maksimumu 590-640 nm aralığında9’dur. Bu ışığa duyarlı etkileri elde etmek için, hiperisin, yerel uygulamadan sonra 405 nm dalga boyunda lazer ışığı tarafından uyarılır10. Işık varlığında, hiperisin virücidal, antiproliferatif ve sitotoksik etkiler gösterebilir11, sistemik toksisite yoktur ve organizmadan hızla salınır. Hiperisin, suda çözünmeyen, floresan olmayan agregalar oluşturan lipofilik bir maddedir, bu nedenle polimerik nanopartiküller 12,13 veya yüksek ve düşük yoğunluklu lipoproteinler (HDL, LDL) 14,15 gibi çeşitli nanotaşıyıcı tipleri, hücrelere verilmesine ve nüfuz etmesine yardımcı olmak için kullanılır. TAT doğal olarak immün yetmezlikli bir sistem olduğundan, tümör hücreleri doğrudan membran yüzeyine implante edilebilir. Model ayrıca, PDT’ye bağlı vasküler hasarın derecesini tanımlanmış bir skor 16,17’ye göre kaydetmek için de çok uygundur. Fotodinamik tanı (PDD) için PDT’ye kıyasla daha düşük yoğunluklu ışık kullanılabilir. Menekşe uyarım LED ışığı altında dokunun izlenmesi aynı zamanda fotosensitizörlerin fotoaktivasyonuna yol açar18,19,20 Bu da floresan ışık emisyonuna neden olur, ancak bir PDT reaksiyonu başlatmak ve hücrelere zarar vermek için yeterli enerji sağlamaz. Tümör görselleştirme ve kullanılmış PSs14,15’in farmakokinetiğini teşhis etmek veya izlemek için iyi bir araçtır.
Bu makalede, bıldırcın ex ovo CAM testinin% 80’in üzerinde hayatta kalma oranları ile hazırlanması anlatılmaktadır. Bu ex ovo kültürü çok sayıda deneyde başarıyla uygulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı ex ovo yetiştiriciliği için, yukarıdaki protokolü takip etmek önemlidir. Ayrıca, yumurtalar yeterince dikkatli açılmazsa veya ekim sırasında yetersiz nem varsa, yumurta sarısı çuvalı kabuğa yapışır ve sıklıkla yırtılır. Yaklaşık 60 saatlik yumurta inkübasyonu sırasında bir ex ovo yetiştiriciliğinin başlaması, embriyoların yüksek hayatta kalma oranını sağlar, çünkü bunlar zaten kullanımdan kurtulacak kadar büyüktür. Daha sonraki gelişim aşamalar?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma VEGA 2/0042/21 ve APVV 20-0129 tarafından desteklenmiştir. V. Huntošová’nın katkısı, proje uygulamasının sonucudur: Tıpta modern disiplinlerarası araştırmalar için açık bilimsel topluluk (Kısaltma: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455, ERDF tarafından finanse edilen Operasyonel Program Entegre Altyapısı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
Referências
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
