Hier wordt een methode beschreven om plantenweefsels transparant te maken met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten. Deze techniek vergemakkelijkt diepe beeldvorming van geklaarde plantenweefsels zonder fysieke doorsnede.
Het is een uitdaging om de interne structuur van meerlagige en ondoorzichtige plantenspecimens direct te observeren, zonder dissectie, onder een microscoop. Bovendien belemmert autofluorescentie toegeschreven aan chlorofyl de observatie van fluorescerende eiwitten in planten. Al lange tijd worden verschillende opruimreagentia gebruikt om planten transparant te maken. Conventionele clearingreagentia verminderen echter fluorescerende signalen; daarom was het niet mogelijk om de cellulaire en intracellulaire structuren met fluorescerende eiwitten te observeren. Er zijn reagentia ontwikkeld die plantenweefsels kunnen verwijderen door chlorofyl te verwijderen met behoud van fluorescerende eiwitstabiliteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor het optisch opruimen van plantenweefsels met behulp van clearingreagentia, ClearSee (CS) of ClearSeeAlpha (CSA). De bereiding van geklaarde plantenweefsels omvat drie stappen: fixatie, wassen en opruimen. Fixatie is een cruciale stap in het behoud van de cellulaire structuren en intracellulaire stabiliteit van fluorescerende eiwitten. De incubatietijd voor het opruimen is afhankelijk van het weefseltype en de soort. In Arabidopsis thaliana was de tijd die nodig was voor het opruimen met CS 4 dagen voor bladeren en wortels, 7 dagen voor zaailingen en 1 maand voor stampers. CS had ook een relatief korte tijd van 4 dagen nodig om de gametofytische bladeren van Physcomitrium patens transparant te maken. Daarentegen produceerden stampers in tabak en torenia bruin pigment als gevolg van oxidatie tijdens CS-behandeling. CSA verminderde het bruine pigment door oxidatie te voorkomen en kon tabak en torenia stampers transparant maken, hoewel het relatief lang duurde (1 of 2 maanden). CS en CSA waren ook compatibel met kleuring met chemische kleurstoffen, zoals DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindool) en Hoechst 33342 voor DNA en Calcofluor White, SR2200 en Direct Red 23 voor de celwand. Deze methode kan nuttig zijn voor beeldvorming van de hele plant om intacte morfologie, ontwikkelingsprocessen, plant-microbe interacties en nematodeninfecties te onthullen.
Visualisatie van cellulaire structuren en lokalisatie van eiwitten in levende organismen is belangrijk voor het verduidelijken van hun functies in vivo. Omdat het levende lichaam echter niet transparant is, is het een uitdaging om de interne structuur van levende organismen zonder dissectie te observeren. Vooral in het geval van plantenweefsels, die meerlagig zijn met cellen van verschillende vormen, is de indexmismatch veroorzaakt door hun structuur en de aanwezigheid van lichtabsorberende pigmenten problematisch. Plantenbladeren hebben bijvoorbeeld een complexe structuur waarmee ze het licht dat hun lichaam binnenkomt efficiënt kunnen gebruiken voor fotosynthese1, terwijl de structuur ook refractieve indexmismatch veroorzaakt, waardoor ze moeilijk waarneembaar zijn. Bladeren hebben echter veel lichtabsorberende pigmenten, zoals chlorofyl, die sterke rode fluorescentie afgeven en bruinachtige pigmenten worden geproduceerd door oxidatie2,3. Deze pigmenten belemmeren ook de waarnemingen van fluorescentiemicroscopie in planten. Daarom worden voor het observeren van de interne structuur van planten ontkleuring en fixatie door alcohol en clearing met behulp van chloraalhydraat al lange tijd gebruikt om de brekingsindexmismatch en autofluorescentie te elimineren4,5. Deze conventionele methoden worden al vele jaren gebruikt, maar ze hebben het nadeel dat ze tegelijkertijd de fluorescentie van fluorescerende eiwitten elimineren6,7. Dit is problematisch omdat fluorescerende eiwitten onmisbaar zijn geworden in de huidige fluorescerende beeldvorming.
Daarom zijn ClearSee (CS) en ClearSeeAlpha (CSA) ontwikkeld als optische clearingreagentia voor plantenweefsels. Beide reagentia verminderen chlorofylautofluorescentie met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten7,8. CSA is vooral nuttig wanneer bruine pigmenten worden geproduceerd als gevolg van weefseloxidatie. Met behulp van deze reinigingsreagentia is het mogelijk om de cellulaire structuur en eiwitlokalisatie in het plantenlichaam te observeren zonder fysieke sectie.
Deze methode bestaat uit fixeren, wassen en reinigen. Fixatie is een cruciale stap in dit protocol. Als het fluorescerende eiwit niet wordt waargenomen na PFA-fixatie, zal het niet worden waargenomen na behandeling met clearingoplossing. De penetratie van PFA-oplossing in weefsels is van cruciaal belang, maar behandeling met een hoog vacuüm wordt niet aanbevolen omdat het de celstructuur kan vernietigen. Vacuümomstandigheden en fixatieperioden moeten worden geoptimaliseerd voor elk type weefsel en soort. Het wordt aanbevolen om fluorescerende eiwitten te controleren, zelfs na fixatie. Hoewel monsters meestal gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur werden gefixeerd, kunnen ze gedurende langere tijd (‘s nachts of langer) op 4 °C worden gefixeerd.
Zoals weergegeven in figuur 6A, hadden sommige natriumdeoxycholaten een lichtgele kleur wanneer ze werden opgelost. Dergelijke natriumdeoxycholaatoplossingen vertoonden sterke autofluorescentie in het gebied van 400-600 nm na excitatie bij 380 nm (figuur 6B). Deze autofluorescentie voorkomt optische clearing en fluorescentie beeldvorming. Gebruikers moeten de kleur van natriumdeoxycholaatoplossing controleren, omdat de kwaliteit van het reagens kan verschillen als gevolg van zuiverheid, partij-tot-partij variatie of andere redenen.
De hier gebruikte clearingoplossingen hebben hoge concentraties natriumdeoxycholaat, die de membraanstructuur kunnen vernietigen. De plasmamembraanmarker (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) werd zelfs na cs-behandeling7 waargenomen. Het kan echter beter zijn om de concentratie natriumdeoxycholaat te verlagen, afhankelijk van de structuur en het weefsel van belang. Inderdaad, beelden met verbeterde helderheid werden verkregen voor Arabidopsis-stampers met gemodificeerd CS, waarbij de concentratie natriumdeoxycholaat met de helft wordt verminderd; verlaagde concentraties natriumdeoxycholaat vereisten echter langere behandelingstijden (bijv. 1 maand voor Arabidopsis-stampers ).
CS kan rode autofluorescentie (>610 nm) verminderen om chlorofyl in behandelde monsters te verwijderen. Autofluorescentie met een bereik van 500-600 nm (geel tot oranje) bleef echter zelfs in met CS behandelde monsters7. Deze autofluorescentie wordt verondersteld te zijn afgeleid van de celwand en andere cellulaire componenten, zoals lignine12,13. Daarom is het moeilijk om weefsels, zoals stengels met ontwikkelde secundaire wanden, volledig transparant te maken door CS-behandeling.
Verschillende reinigingsreagentia naast de hier gebruikte zijn ontwikkeld om fluorescerende eiwitten in planten te observeren met behulp van fluorescerende microscopie14,15,16,17. In vergelijking met deze methoden verwijderen CS en CSA chlorofyl en verminderen ze autofluorescentie, waardoor de plantenweefsels transparanter worden. Onlangs ontwikkelden Sakamoto et al. een verbeterde methode, iTOMEI, voor fixatie, reinigingsmiddelreiniging en montage om de brekingsindexmismatch aan te passen18. Bij Arabidopsis-zaailingen wiste iTOMEI het weefsel binnen 26 uur.
CS is toepasbaar op een breed scala aan plantensoorten, zoals Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, gerst22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, maize26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soybean33, strawberry34, wheat35 pt Wolffiella hyalina36. Voor dikkere weefsels kan CS ook de vibratome-secties transparant maken37,38. Deze methode maakte studies van de cellulaire structuur en genexpressiepatronen in planten mogelijk37,38. Bovendien werden nematodeninfecties20,39, schimmelinfecties en symbiose19,40,41 ook diep in de met CS behandelde weefsels waargenomen. Deze methode is dus nuttig voor beeldvorming van het hele weefsel van micro- tot macroschalen en kan helpen om nieuwe interacties tussen verschillende cellen, weefsels, organen en organismen te ontdekken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 to T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 to D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 to D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) en het Japan Science and Technology Agency (PRESTO program (JPMJPR15QC to Y.M., JPMJPR18K4 naar D.K.)). De auteurs zijn het Live Imaging Center van het Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) van nagoya university dankbaar voor het ondersteunen van de microscopische studies en Editage (www.editage.com) voor Engelstalige bewerking.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |