طريقة قوية لإنتاج الكرويات على نطاق واسع لتطبيقات الفحص والتحليل عالية المحتوى
Summary
يفصل هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ثلاثة أنواع مختلفة من الكرويات بطريقة تجعلها مناسبة للفحص والتحليل عالي المحتوى على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم أمثلة توضح كيف يمكن تحليلها على مستويات الخلايا الكروية والفردية.
Abstract
الفحص عالي المحتوى (HCS) والتحليل عالي المحتوى (HCA) هما تقنيتان توفران للباحثين القدرة على استخراج قياسات النمط الظاهري الكمي واسعة النطاق من الخلايا. وقد أثبت هذا النهج قوته في تعميق فهمنا لمجموعة واسعة من الأحداث الأساسية والتطبيقية في بيولوجيا الخلية. حتى الآن ، اعتمدت غالبية تطبيقات هذه التكنولوجيا على استخدام الخلايا المزروعة في الطبقات الأحادية ، على الرغم من أنه من المعلوم بشكل متزايد أن هذه النماذج لا تلخص العديد من التفاعلات والعمليات التي تحدث في الأنسجة. على هذا النحو ، كان هناك ظهور في تطوير واستخدام جمعيات الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) ، مثل الكرويات والمواد العضوية. على الرغم من أن هذه النماذج 3D قوية بشكل خاص في سياق بيولوجيا السرطان ودراسات تسليم الأدوية ، إلا أن إنتاجها وتحليلها بطريقة قابلة للتكرار مناسبة ل HCS و HCA يمثل عددا من التحديات. يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة لتوليد الكرويات متعددة الخلايا (MCTS) ، ويوضح أنه يمكن تطبيقها على ثلاثة خطوط خلايا مختلفة بطريقة متوافقة مع HCS و HCA. وتسهل هذه الطريقة إنتاج عدة مئات من الكرويات لكل بئر، مما يوفر ميزة محددة تتمثل في أنه عند استخدامها في نظام الفحص، يمكن الحصول على البيانات من عدة مئات من الهياكل لكل بئر، ومعالجتها جميعا بطريقة متطابقة. كما يتم تقديم أمثلة توضح بالتفصيل كيفية معالجة الكرويات للتصوير الفلوري عالي الدقة وكيف يمكن ل HCA استخراج الميزات الكمية على كل من المستوى الكروي وكذلك من الخلايا الفردية داخل كل كروية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهولة للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة المهمة في بيولوجيا الخلية.
Introduction
تقليديا ، تم إجراء الفحوصات القائمة على الخلايا في طبقات أحادية تنمو على ركيزة صلبة ، والتي يمكن اعتبارها بشكل فعال بيئة ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، أصبح من المعترف به بشكل متزايد أن نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد تفتقر إلى الأهمية الفسيولوجية في بعض السياقات ولا يمكنها تكرار العديد من التفاعلات المعقدة التي تحدث بين الخلايا 1. أصبحت طرق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) شائعة بسرعة بين الباحثين ، وتظهر نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد إمكانات عالية لمحاكاة الظروف الفسيولوجية التي تواجهها الخلايا في بيئة الأنسجة بشكل أفضل2. هناك عدة أنواع مختلفة من تجمعات الخلايا 3D التي تم استخدامها ، ولكن النوعين الأكثر شيوعا هما الكرويات والعضوية. يمكن زراعة الكرويات من العديد من خطوط الخلايا المختلفة، ويمكنها اعتماد أشكال وأحجام مختلفة اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة وطريقة تجميعها3. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا الإشارة إلى الكرويات باسم الكرويات متعددة الخلايا (MCTS) عندما تزرع من خطوط الخلايا السرطانية ، وقد وجدت هذه النماذج استخداما خاصا لتوصيل الأدوية قبل السريرية في المختبر ودراسات السمية4,5. من ناحية أخرى ، تهدف المواد العضوية إلى محاكاة الأنسجة والأعضاء في أجسامنا بشكل أفضل ويمكن أن تعتمد ترتيبات مورفولوجية أكثر تعقيدا. ينطوي إنتاج المواد العضوية على استخدام الخلايا الجذعية البالغة أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، والتي يمكن إعادة برمجتها في الخلايا المناسبة لتشبه الأنسجة أو الأعضاء ذات الاهتمام. وهي تستخدم في المقام الأول للتحقيق في تطور الأعضاء ونمذجة الأمراض والتفاعلات بين المضيف والممرضات6.
هناك مجموعة من الطرق المختلفة المستخدمة لإنشاء تجميعات خلايا 3D. توفر الطرق القائمة على السقالات ركيزة أو دعما يمكن للخلايا أن تلتصق به أو تنمو داخله. يمكن أن يكون لهذه السقالات أشكال مختلفة ويمكن تصنيعها من مجموعة متنوعة من المواد المختلفة. الأكثر شيوعا هي مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) والمواد الهلامية المائية ، وهي مصممة لتشبه البيئة الطبيعية خارج الخلية للخلايا وبالتالي تسهيل التفاعلات الفسيولوجية4,7. تم استخراج مادة الطابق السفلي ECM من ورم ساركوما الفئران Engelbreth-Holm-Swarm وتبين أنها تحتوي على مزيج غني من مكونات ECM ، بما في ذلك laminin والكولاجين من النوع الرابع و perlecan8. ومع ذلك ، على الرغم من تكوينه المفيد ، هناك تحديان رئيسيان في استخدامه ، وهما تقلبه من دفعة إلى أخرى وأن لديه حالتين مختلفتين من المجموع أقل وفوق 10 درجات مئوية 8,9. في المقابل ، تتمتع الهيدروجيل بميزة المرونة فيما يتعلق بمكوناتها وصلابتها ، ويمكن تخصيصها لتناسب مجموعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المحددة المطلوبة7,10. الطرق القائمة على السقالات ضرورية للنمو العضوي ولكنها تستخدم أيضا على نطاق واسع للكرويات. عادة ما تكون الطرق الخالية من السقالات ، والتي تعمل عن طريق منع الخلايا من الالتصاق بالسطح الذي تنمو عليه ، متوافقة فقط مع التجميع الكروي. ومن الأمثلة على ذلك لوحات التعلق المنخفضة للغاية (ULA) ، إما مع قاع مسطح أو قاع U ، مما يسمح بتجميع الخلايا في كرويات ، أو استخدام التحريض المستمر للخلايا في قوارير الدوران / الدوران 10.
استخدام جمعيات الخلايا 3D لدراسة مجموعة واسعة من الأحداث البيولوجية يكتسب شعبية بسرعة. ومع ذلك ، من الضروري أن تكون الطريقة المختارة لثقافتهم مناسبة ومتوافقة مع خطط تحليلهم النهائي. على سبيل المثال ، يولد استخدام لوحات ULA كرويات ذات اتساق عال. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطريقة على إنتاج كروي واحد لكل بئر ، مما يحد من الإنتاجية. هناك حاجة إلى اعتبار خاص عند التخطيط للتصوير الفلوري لهيكل 3D. يجب أن تكون الركيزة أو اللوحة التي تزرع عليها المجموعة متوافقة بصريا ، ويجب توخي الحذر لتقليل آثار تشتت الضوء الناجم عن أي سقالات قد تكون استخدمت 11. تصبح هذه المشكلة بالذات أكثر حدة مع زيادة الفتحة العددية للعدسات الموضوعية المجهرية.
يمكن القول إن أحد الأسباب الرئيسية لاختيار العمل مع نموذج خلية 3D هو استخراج بيانات التصوير الحجمي ليس فقط حول التجميع بأكمله ولكن أيضا الخلايا الفردية داخله. بدأت نماذج MCTS ، على وجه الخصوص ، تثبت قوتها الكبيرة لتعميق فهمنا لكيفية انتقال العلاجات من الخارج إلى الخلايا المركزية (كما تحتاج إلى ذلك في الورم)12 ، وبالتالي فإن اكتساب المعرفة من الخلايا الفردية في طبقات مختلفة أمر ضروري. تسمى تقنية التصوير التي تستخرج المعلومات الكمية من الخلايا الفردية تحليل المحتوى العالي (HCA) وهي نهج قوي في سياق الفحص13. حتى الآن ، تم تطبيق HCA بشكل حصري تقريبا على ثقافات الطبقة الأحادية ، ولكن هناك إدراك متزايد بأن هذا النهج لديه القدرة على تطبيقه على ثقافات 3D مما يتيح دراسة مجموعة واسعة من الوظائف والعمليات الخلوية14. سيكون لها ميزة واضحة أنه يمكن تحليل أعداد كبيرة من التجميعات 3D ، مما قد يوفر بيانات على مستوى الخلية من جميع أنحاء كل هيكل. ومع ذلك ، يجب التغلب على التحديات المرتبطة بتصوير مجموعات الخلايا التي يحتمل أن تكون سميكة ، وكذلك مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها.
في هذه المقالة ، يتم تقديم طريقة قوية قائمة على السقالات لإنتاج MCTS على نطاق واسع بتنسيق 96 بئرا. تسهل هذه الطريقة إنتاج عدة مئات من تجميعات الخلايا 3D في كل بئر. يتم عرض أمثلة لثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا ، تمثل نماذج الورم الصلب للكبد والرئة والقولون. يمكن أن تكون الكرويات التي تتشكل من مجموعة متنوعة من الأحجام ، وبالتالي يتم استخدام HCA لاختيار هياكل ذات حجم و / أو مورفولوجيا معينة. توفر هذه الميزة ميزة إضافية تتمثل في إمكانية مقارنة أي أنماط ظاهرية لوحظت عبر كرويات ذات أحجام مختلفة ، ولكن جميعها تعامل بنفس الطريقة في نفس البئر. يتوافق هذا النهج مع التصوير عالي الدقة ، والأهم من ذلك توفير بيانات كمية على مستوى الخلية وتحت الخلية من نفس التجميعات الخلوية. وتتمتع طريقة الإنتاج الكروي هذه بميزة إضافية على الطرق التي تولد كروية واحدة لكل بئر، وأن الأعداد الكبيرة من الكرويات المنتجة في كل بئر يحتمل أن توفر كتلة حيوية كافية للتحليلات النهائية الأخرى، مثل التنميط النسخي والبروتيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
يفصل النهج الموصوف هنا منصة لتوليد عدة مئات من الكرويات لكل بئر بطريقة مناسبة ل HCS و HCA. بالمقارنة مع الطرق الشائعة الأخرى ، مثل استخدام لوحات ULA ذات القاع المسطح والدائري القاع ، والتي تسمح بتكوين كروي واحد فقط لكل بئر18,19 ، توفر هذه الطريقة الفرصة لاستخراج مع…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بدعم منحة أبحاث البنية التحتية من مؤسسة العلوم الأيرلندية (SFI) (16/RI/3745) إلى JCS. يتم دعم العمل في مختبر فحص الخلايا UCD من قبل كلية UCD للعلوم. يتم تمويل ASC من قبل منحة الدراسات العليا التابعة لمجلس البحوث الأيرلندي (IRC) التابع لحكومة أيرلندا (GOIPG/2019/68). كما يشكر المؤلفون جميع أعضاء المختبر على مدخلاتهم ومناقشاتهم المفيدة. تم إنشاء العمل الفني في الشكل 1 في BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
Referências
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods’ interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
