उच्च सामग्री स्क्रीनिंग और विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए गोलाकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक मजबूत विधि
Summary
यह प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग प्रकार के गोलाकार के उत्पादन के लिए एक विधि का विवरण देता है जो उन्हें बड़े पैमाने पर उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग और विश्लेषण के लिए उपयुक्त बनाता है। इसके अलावा, उदाहरण प्रस्तुत किए गए हैं जो दिखाते हैं कि उन्हें गोलाकार और व्यक्तिगत सेल स्तरों पर कैसे विश्लेषण किया जा सकता है।
Abstract
उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) और उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) ऐसी प्रौद्योगिकियां हैं जो शोधकर्ताओं को कोशिकाओं से बड़े पैमाने पर मात्रात्मक फेनोटाइपिक माप निकालने की क्षमता प्रदान करती हैं। यह दृष्टिकोण सेल जीव विज्ञान में मौलिक और लागू दोनों घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की हमारी समझ को गहरा करने के लिए शक्तिशाली साबित हुआ है। आज तक, इस तकनीक के लिए अधिकांश अनुप्रयोगों ने मोनोलेयर्स में उगाई गई कोशिकाओं के उपयोग पर भरोसा किया है, हालांकि यह तेजी से महसूस किया जाता है कि इस तरह के मॉडल ऊतकों में होने वाली कई इंटरैक्शन और प्रक्रियाओं को दोहराते नहीं हैं। इस प्रकार, 3-आयामी (3 डी) सेल असेंबली के विकास और उपयोग में एक उद्भव हुआ है, जैसे कि गोलाकार और ऑर्गेनोइड्स। हालांकि ये 3 डी मॉडल कैंसर जीव विज्ञान और दवा वितरण अध्ययनों के संदर्भ में विशेष रूप से शक्तिशाली हैं, एचसीएस और एचसीए के लिए उपयुक्त पुनरुत्पादक तरीके से उनके उत्पादन और विश्लेषण कई चुनौतियां पेश करते हैं। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार (एमसीटीएस) की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, और यह दर्शाता है कि इसे तीन अलग-अलग सेल लाइनों पर इस तरह से लागू किया जा सकता है जो एचसीएस और एचसीए के साथ संगत है। यह विधि प्रति अच्छी तरह से कई सौ गोलाकार के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है, विशिष्ट लाभ प्रदान करती है कि जब स्क्रीनिंग शासन में उपयोग किया जाता है, तो डेटा को कई सौ संरचनाओं से प्राप्त किया जा सकता है, सभी को एक समान तरीके से इलाज किया जा सकता है। उदाहरण भी प्रदान किए जाते हैं, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए गोलाकार को संसाधित करने के तरीके का विवरण देते हैं और एचसीए गोलाकार स्तर के साथ-साथ प्रत्येक गोलाकार के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं से मात्रात्मक विशेषताओं को कैसे निकाल सकता है। इस प्रोटोकॉल को सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्तर देने के लिए आसानी से लागू किया जा सकता है।
Introduction
परंपरागत रूप से, सेल-आधारित assays एक ठोस सब्सट्रेट पर बढ़ रहे मोनोलेयर्स में प्रदर्शन किया गया है, जिसे प्रभावी ढंग से दो आयामी (2 डी) वातावरण के रूप में माना जा सकता है। हालांकि, यह तेजी से मान्यता प्राप्त हो रही है कि 2 डी सेल संस्कृति मॉडल में कुछ संदर्भों में शारीरिक प्रासंगिकता की कमी है और कोशिकाओं के बीच होने वाले कई जटिल इंटरैक्शन को दोहरा नहीं सकता है। तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति विधियां शोधकर्ताओं के बीच तेजी से लोकप्रिय हो रही हैं, और 3 डी सेल मॉडल ऊतक वातावरण में कोशिकाओं द्वारा सामना की जाने वाली शारीरिक स्थितियों की बेहतर नकल करने के लिए उच्च क्षमता दिखाते हैं2। कई अलग-अलग प्रकार के 3 डी सेल असेंबली हैं जिन्हें नियोजित किया गया है, लेकिन दो सबसे आम प्रकार गोलाकार और ऑर्गेनोइड हैं। गोलाकार को कई अलग-अलग सेल लाइनों से उगाया जा सकता है, और वे उपयोग किए गए सेल प्रकार और असेंबली 3 की उनकी विधि के आधार पर विभिन्न आकारों और आकारों को अपना सकते हैं। इसके अलावा, गोलाकार को बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार (एमसीटीएस) के रूप में भी संदर्भित किया जा सकता है जब वे कैंसर सेल लाइनों से उगाए जाते हैं, और इन मॉडलों ने प्रीक्लिनिकल इन विट्रो ड्रग डिलीवरी और विषाक्तता अध्ययन 4,5 के लिए विशेष उपयोग पाया है। दूसरी ओर, ऑर्गेनोइड्स का उद्देश्य हमारे शरीर में ऊतकों और अंगों की बेहतर नकल करना है और अधिक जटिल रूपात्मक व्यवस्थाओं को अपना सकते हैं। ऑर्गेनोइड्स के उत्पादन में वयस्क स्टेम कोशिकाओं या प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग शामिल है, जिन्हें ऊतक या ब्याज के अंग के समान होने के लिए उपयुक्त कोशिकाओं में फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है। वे मुख्य रूप से अंगों के विकास की जांच करने और रोगों और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए उपयोग किए जाते हैं6।
3D सेल असेंबली उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली विभिन्न विधियों की एक श्रृंखला है। पाड़-आधारित विधियां एक सब्सट्रेट या समर्थन प्रदान करती हैं जिसके लिए कोशिकाएं या तो संलग्न या भीतर बढ़ सकती हैं। इन scaffolds विभिन्न आकार हो सकता है और विभिन्न सामग्री की एक किस्म से बनाया जा सकता है. सबसे आम बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) घटक और हाइड्रोजेल हैं, और उन्हें कोशिकाओं के प्राकृतिक बाह्य कोशिकीय वातावरण के समान होने के लिए डिज़ाइन किया गया है और इस प्रकार शारीरिक इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करता है4,7। ईसीएम तहखाने सामग्री Engelbreth-Holm-Swarm माउस सारकोमा ट्यूमर से निकाला गया है और लैमिनिन, प्रकार IV कोलेजन, और perlecan8 सहित ईसीएम घटकों का एक समृद्ध मिश्रण शामिल करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इसकी लाभप्रद संरचना के बावजूद, इसके उपयोग के साथ दो मुख्य चुनौतियां हैं, अर्थात् इसकी बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता और इसमें 10 डिग्री सेल्सियस 8,9 से नीचे और ऊपर दो अलग-अलग कुल राज्य हैं। इसके विपरीत, हाइड्रोजेल को अपने घटकों और कठोरता के संबंध में लचीला होने का लाभ होता है, और उन्हें विशिष्ट 3 डी सेल असेंबली वांछित 7,10 के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। पाड़-आधारित तरीके ऑर्गेनोइड विकास के लिए आवश्यक हैं, लेकिन व्यापक रूप से गोलाकार के लिए भी उपयोग किए जाते हैं। पाड़-मुक्त तरीके, जो कोशिकाओं को उस सतह से जुड़ने से रोककर काम करते हैं जिस पर वे बढ़ रहे हैं, आमतौर पर केवल गोलाकार असेंबली के साथ संगत होते हैं। उदाहरणों में अल्ट्रा-लो अटैचमेंट (यूएलए) प्लेटें शामिल हैं, या तो एक फ्लैट बॉटम या यू-बॉटम के साथ, जो कोशिकाओं को गोलाकार में एकत्रीकरण की अनुमति देता है, या स्पिनर / रोटेशन फ्लास्क 10 में कोशिकाओं के निरंतर आंदोलन का उपयोग करता है।
जैविक घटनाओं की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए 3 डी सेल असेंबली का उपयोग तेजी से लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है; हालांकि, यह आवश्यक है कि उनकी संस्कृति के लिए चुनी गई विधि उनके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए योजनाओं के साथ उपयुक्त और संगत हो। उदाहरण के लिए, यूएलए प्लेटों का उपयोग उच्च स्थिरता के गोलाकार उत्पन्न करता है; हालांकि, यह विधि प्रति अच्छी तरह से एक एकल गोलाकार के उत्पादन तक सीमित है, जिससे थ्रूपुट सीमित हो जाता है। विशेष रूप से विचार की आवश्यकता होती है जब 3 डी संरचना की प्रतिदीप्ति इमेजिंग की योजना बनाई जाती है। सब्सट्रेट या प्लेट जिस पर असेंबली उगाई जाती है, उसे ऑप्टिकल रूप से संगत होने की आवश्यकता होती है, और किसी भी मचान के कारण प्रकाश प्रकीर्णन के प्रभावों को कम करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए जिसका उपयोग किया जा सकता है11। यह विशेष समस्या अधिक तीव्र हो जाती है क्योंकि माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर बढ़ जाता है।
यकीनन 3 डी सेल मॉडल के साथ काम करने के लिए चयन करने के प्रमुख कारणों में से एक न केवल पूरे असेंबली के बारे में वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग डेटा निकालना है, बल्कि इसके भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के बारे में भी है। एमसीटीएस मॉडल, विशेष रूप से, हमारी समझ को गहरा करने के लिए बहुत शक्तिशाली साबित होने लगे हैं कि कैसे चिकित्सीय बाहर से केंद्रीय कोशिकाओं में पारगमन करते हैं (जैसा कि उन्हें ट्यूमर में करने की आवश्यकता होगी)12, और इसलिए विभिन्न परतों पर व्यक्तिगत कोशिकाओं से ज्ञान प्राप्त करना आवश्यक है। इमेजिंग तकनीक जो व्यक्तिगत कोशिकाओं से मात्रात्मक जानकारी निकालती है, उसे उच्च-सामग्री विश्लेषण (एचसीए) कहा जाता है और स्क्रीनिंग 13 के संदर्भ में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। आज तक, एचसीए को लगभग विशेष रूप से मोनोलेयर संस्कृतियों पर लागू किया गया है, लेकिन एक बढ़ती हुई प्राप्ति है कि इस दृष्टिकोण में 3 डी संस्कृतियों पर लागू होने की शक्ति है जो सेलुलर कार्यों और प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम करती है। इसका स्पष्ट लाभ होगा कि बड़ी संख्या में 3 डी असेंबली का विश्लेषण किया जा सकता है, संभावित रूप से प्रत्येक संरचना से सेल-स्तर का डेटा प्रदान किया जा सकता है। हालांकि, संभावित मोटी सेल असेंबली की इमेजिंग से जुड़ी चुनौतियों, साथ ही साथ उत्पन्न बड़े डेटा सेट को दूर करने की आवश्यकता है।
इस लेख में, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में MCTS के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक मजबूत पाड़-आधारित विधि प्रस्तुत की गई है। विधि प्रत्येक कुएं में कई सौ 3 डी सेल असेंबली के उत्पादन की सुविधा प्रदान करती है। उदाहरण तीन अलग-अलग सेल प्रकारों के लिए दिखाए गए हैं, जो यकृत, फेफड़े और बृहदान्त्र के ठोस ट्यूमर मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। गोलाकार जो बनते हैं, विभिन्न आकारों के हो सकते हैं, और इसलिए एचसीए का उपयोग किसी विशेष आकार और / या आकृति विज्ञान की संरचनाओं का चयन करने के लिए किया जाता है। यह सुविधा अतिरिक्त लाभ प्रदान करती है कि देखे गए किसी भी फेनोटाइप की तुलना विभिन्न आकारों के गोलाकार में की जा सकती है, लेकिन सभी को एक ही तरह से एक ही तरह से अच्छी तरह से इलाज किया जाता है। यह दृष्टिकोण उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ संगत है, महत्वपूर्ण रूप से एक ही सेलुलर असेंबली से सेल-स्तर और उपकोशिकीय स्तर मात्रात्मक डेटा दोनों प्रदान करता है। गोलाकार उत्पादन की इस विधि में उन तरीकों पर अतिरिक्त लाभ है जो प्रति अच्छी तरह से एक एकल गोलाकार उत्पन्न करते हैं, कि प्रत्येक अच्छी तरह से उत्पादित गोलाकार की बड़ी संख्या संभावित रूप से अन्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए पर्याप्त बायोमास प्रदान करती है, जैसे कि ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटिओम प्रोफाइलिंग।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित दृष्टिकोण में एचसीएस और एचसीए के लिए उपयुक्त तरीके से कई सौ गोलाकार प्रति अच्छी तरह से उत्पन्न करने के लिए एक मंच का विवरण दिया गया है। अन्य लोकप्रिय तरीकों की तुलना में, जैसे कि फ्लैट-बॉटम ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने विज्ञान फाउंडेशन आयरलैंड (एसएफआई) (16 / आरआई / 3745) से जेसीएस के लिए एक बुनियादी ढांचे के अनुसंधान अनुदान के समर्थन को स्वीकार किया। यूसीडी सेल स्क्रीनिंग प्रयोगशाला में काम यूसीडी कॉलेज ऑफ साइंस द्वारा समर्थित है। एएससी को आयरिश रिसर्च काउंसिल (आईआरसी) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है आयरलैंड स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (जीओआईपीजी / 2019 /68) की सरकार। लेखकों ने प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उनके इनपुट और उपयोगी चर्चाओं के लिए भी धन्यवाद दिया। चित्रा 1 में कलाकृति BioRender में उत्पन्न किया गया था।
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
Referências
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods’ interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
