Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l’analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.
Abstract
Lo screening ad alto contenuto (HCS) e l’analisi ad alto contenuto (HCA) sono tecnologie che forniscono ai ricercatori la capacità di estrarre misurazioni fenotipiche quantitative su larga scala dalle cellule. Questo approccio si è dimostrato potente per approfondire la nostra comprensione di una vasta gamma di eventi sia fondamentali che applicati nella biologia cellulare. Ad oggi, la maggior parte delle applicazioni per questa tecnologia si è basata sull’uso di cellule cresciute in monostrati, anche se è sempre più consapevole che tali modelli non ricapitolano molte delle interazioni e dei processi che si verificano nei tessuti. Come tale, c’è stato un emergere nello sviluppo e nell’uso di assemblaggi cellulari tridimensionali (3D), come sferoidi e organoidi. Sebbene questi modelli 3D siano particolarmente potenti nel contesto della biologia del cancro e degli studi sulla somministrazione di farmaci, la loro produzione e analisi in modo riproducibile adatto a HCS e HCA presenta una serie di sfide. Il protocollo qui dettagliato descrive un metodo per la generazione di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) e dimostra che può essere applicato a tre diverse linee cellulari in modo compatibile con HCS e HCA. Il metodo facilita la produzione di diverse centinaia di sferoidi per pozzo, fornendo il vantaggio specifico che, se utilizzato in un regime di screening, i dati possono essere ottenuti da diverse centinaia di strutture per pozzo, tutte trattate in modo identico. Vengono inoltre forniti esempi, che descrivono in dettaglio come elaborare gli sferoidi per l’imaging a fluorescenza ad alta risoluzione e come l’HCA può estrarre caratteristiche quantitative sia a livello sferoide che da singole cellule all’interno di ciascun sferoide. Questo protocollo potrebbe essere facilmente applicato per rispondere a una vasta gamma di domande importanti nella biologia cellulare.
Introduction
Tradizionalmente, i saggi basati su cellule sono stati eseguiti in monostrati che crescono su un substrato solido, che può effettivamente essere considerato come un ambiente bidimensionale (2D). Tuttavia, sta diventando sempre più riconosciuto che i modelli di coltura cellulare 2D mancano di rilevanza fisiologica in alcuni contesti e non possono replicare molte delle complesse interazioni che si verificano tra le cellule1. I metodi di coltura cellulare tridimensionale (3D) stanno rapidamente diventando popolari tra i ricercatori e i modelli cellulari 3D mostrano un alto potenziale per imitare meglio le condizioni fisiologiche incontrate dalle cellule nell’ambiente tissutale2. Esistono diversi tipi di assemblaggi di celle 3D che sono stati impiegati, ma i due tipi più comuni sono sferoidi e organoidi. Gli sferoidi possono essere coltivati da molte linee cellulari diverse e possono adottare varie forme e dimensioni a seconda del tipo di cellula utilizzata e del loro metodo di assemblaggio3. Inoltre, gli sferoidi possono anche essere indicati come sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) quando sono cresciuti da linee cellulari tumorali, e questi modelli hanno trovato particolare uso per la somministrazione preclinica in vitro di farmaci e studi di tossicità4,5. Gli organoidi, d’altra parte, mirano a imitare meglio i tessuti e gli organi del nostro corpo e possono adottare disposizioni morfologiche più complesse. La produzione di organoidi comporta l’uso di cellule staminali adulte o cellule staminali pluripotenti, che possono essere riprogrammate nelle cellule appropriate per assomigliare al tessuto o all’organo di interesse. Sono utilizzati principalmente per studiare lo sviluppo di organi e per modellare malattie e interazioni ospite-patogeno6.
Esiste una gamma di metodi diversi utilizzati per generare assiemi di celle 3D. I metodi basati su scaffold forniscono un substrato o un supporto a cui le cellule possono attaccarsi o crescere all’interno. Queste impalcature possono avere varie forme e possono essere realizzate con una varietà di materiali diversi. I più comuni sono i componenti della matrice extracellulare (ECM) e gli idrogel, e sono progettati per assomigliare all’ambiente extracellulare naturale delle cellule e quindi facilitare le interazioni fisiologiche4,7. Il materiale basale ECM è stato estratto dal tumore del sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm e ha dimostrato di contenere una ricca miscela di componenti ECM, tra cui laminina, collagene di tipo IV e perlecan8. Tuttavia, nonostante la sua composizione vantaggiosa, ci sono due sfide principali con il suo uso, vale a dire la sua variabilità da lotto a lotto e che ha due diversi stati aggregati al di sotto e al di sopra di 10 °C8,9. Al contrario, gli idrogel hanno il vantaggio di essere flessibili rispetto ai loro componenti e alla rigidità e possono essere personalizzati per adattarsi allo specifico assemblaggio di celle 3D desiderato7,10. I metodi basati su scaffold sono essenziali per la crescita degli organoidi, ma sono anche ampiamente utilizzati per gli sferoidi. I metodi senza impalcature, che funzionano impedendo alle cellule di attaccarsi alla superficie su cui stanno crescendo, sono solitamente compatibili solo con l’assemblaggio sferoide. Gli esempi includono piastre di attacco ultra-basso (ULA), con fondo piatto o fondo a U, che consentono l’aggregazione delle cellule in sferoidi o l’uso di agitazione continua delle cellule in palloni spinner/rotazione10.
L’uso di assemblaggi cellulari 3D per studiare un’ampia varietà di eventi biologici sta rapidamente guadagnando popolarità; tuttavia, è essenziale che il metodo scelto per la loro cultura sia appropriato e compatibile con i piani per la loro analisi a valle. Ad esempio, l’uso di piastre ULA genera sferoidi di elevata consistenza; tuttavia, questo metodo è limitato alla produzione di un singolo sferoide per pozzetto, limitando così la produttività. Particolare considerazione è necessaria quando si pianifica l’imaging a fluorescenza della struttura 3D. Il substrato o la piastra su cui viene coltivato l’assemblaggio deve essere otticamente compatibile e occorre prestare attenzione per ridurre al minimo gli effetti della dispersione della luce causati da eventuali impalcature che potrebbero essere state utilizzate11. Questo particolare problema diventa più acuto all’aumentare dell’apertura numerica delle lenti degli obiettivi del microscopio.
Probabilmente uno dei motivi principali per scegliere di lavorare con un modello di cella 3D è quello di estrarre dati di imaging volumetrico non solo sull’intero assemblaggio ma anche sulle singole celle al suo interno. I modelli MCTS, in particolare, stanno iniziando a dimostrarsi molto potenti per approfondire la nostra comprensione di come le terapie transitano dall’esterno alle cellule centrali (come avrebbero bisogno in un tumore)12, e quindi acquisire conoscenze da singole cellule a diversi strati è essenziale. La tecnologia di imaging che estrae informazioni quantitative dalle singole cellule è definita analisi ad alto contenuto (HCA) ed è un approccio potente nel contesto dello screening13. Ad oggi, l’HCA è stato applicato quasi esclusivamente alle colture monostrato, ma c’è una crescente consapevolezza che questo approccio ha il potere di essere applicato alle colture 3D consentendo di studiare una vasta gamma di funzioni e processi cellulari14. Avrebbe il chiaro vantaggio che un gran numero di assiemi 3D potrebbe essere analizzato, fornendo potenzialmente dati a livello di cella da ogni struttura. Tuttavia, le sfide associate all’imaging di assemblaggi di celle potenzialmente spesse, nonché i grandi set di dati generati, devono essere superati.
In questo articolo viene presentato un robusto metodo basato su scaffold per la produzione su larga scala di MCTS in un formato a 96 pozzetti. Il metodo facilita la produzione di diverse centinaia di assemblaggi di celle 3D in ogni pozzo. Esempi sono mostrati per tre diversi tipi di cellule, che rappresentano modelli di tumore solido del fegato, del polmone e del colon. Gli sferoidi che si formano possono essere di una varietà di dimensioni, e quindi HCA viene utilizzato per selezionare strutture di una particolare dimensione e / o morfologia. Questa caratteristica fornisce l’ulteriore vantaggio che qualsiasi fenotipo osservato può essere confrontato tra sferoidi di diverse dimensioni, ma tutti trattati allo stesso modo nello stesso pozzo. Questo approccio è compatibile con l’imaging ad alta risoluzione, fornendo dati quantitativi sia a livello cellulare che subcellulare dagli stessi assemblaggi cellulari. Questo metodo di produzione di sferoidi ha l’ulteriore vantaggio rispetto ai metodi che generano un singolo sferoide per pozzo, che il gran numero di sferoidi prodotti in ciascun pozzo fornisce potenzialmente biomassa sufficiente per altre analisi a valle, come il trascrittoma e la profilazione del proteoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approccio qui descritto descrive una piattaforma per generare diverse centinaia di sferoidi per pozzo in un modo adatto per HCS e HCA. Rispetto ad altri metodi popolari, come l’uso di piastre ULA a fondo piatto e a fondo tondo, che consentono la formazione di un solo sferoide per pozzo18,19, questo metodo offre l’opportunità di estrarre informazioni ad alta risoluzione da un gran numero di sferoidi in un formato di screening. In particolare, questo metodo è s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno di una sovvenzione per la ricerca sulle infrastrutture da parte della Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) a JCS. Il lavoro nel laboratorio di screening delle cellule UCD è supportato dall’UCD College of Science. ASC è finanziato da una borsa di studio post-laurea del governo irlandese del Consiglio della ricerca (IRC) (GOIPG / 2019/68). Gli autori ringraziano anche tutti i membri del laboratorio per il loro contributo e le discussioni utili. La grafica nella Figura 1 è stata generata in BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
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