Denne protokollen beskriver en metode for produksjon av tre forskjellige typer sfæroider på en måte som gjør dem egnet for screening og analyse av høyt innhold i stor skala. I tillegg presenteres eksempler som viser hvordan de kan analyseres ved sfæroid og individuelle cellenivåer.
Høyinnholdsscreening (HCS) og høyinnholdsanalyse (HCA) er teknologier som gir forskere muligheten til å trekke ut store kvantitative fenotypiske målinger fra celler. Denne tilnærmingen har vist seg kraftig for å utdype vår forståelse av et bredt spekter av både grunnleggende og anvendte hendelser i cellebiologi. Til dags dato har flertallet av applikasjonene for denne teknologien stolt på bruk av celler dyrket i monolayers, selv om det i økende grad er realisert at slike modeller ikke rekapitulerer mange av interaksjonene og prosessene som forekommer i vev. Som sådan har det vært en fremvekst i utviklingen og bruken av 3-dimensjonale (3D) cellesamlinger, som sfæroider og organoider. Selv om disse 3D-modellene er spesielt kraftige i sammenheng med kreftbiologi og legemiddelleveringsstudier, gir deres produksjon og analyse på en reproduserbar måte egnet for HCS og HCA en rekke utfordringer. Protokollen som er beskrevet her beskriver en metode for generering av multicellulære tumorsfæroider (MCTS), og viser at den kan brukes på tre forskjellige cellelinjer på en måte som er kompatibel med HCS og HCA. Metoden letter produksjonen av flere hundre sfæroider per brønn, noe som gir den spesifikke fordelen at når de brukes i et screeningregime, kan data fås fra flere hundre strukturer per brønn, alt behandlet på en identisk måte. Eksempler er også gitt, som beskriver hvordan du behandler sfæroidene for høyoppløselig fluorescensavbildning og hvordan HCA kan trekke ut kvantitative egenskaper både på sfæroidnivå og fra individuelle celler i hver sfæroid. Denne protokollen kan lett brukes til å svare på et bredt spekter av viktige spørsmål i cellebiologi.
Tradisjonelt har cellebaserte analyser blitt utført i monolayers som vokser på et solidt substrat, som effektivt kan betraktes som et todimensjonalt (2D) miljø. Imidlertid blir det stadig mer anerkjent at 2D-cellekulturmodeller mangler fysiologisk relevans i noen sammenhenger og ikke kan gjenskape mange av de komplekse interaksjonene som oppstår mellom celler1. Tredimensjonale (3D) cellekulturmetoder blir raskt populære blant forskere, og 3D-cellemodeller viser høyt potensial for bedre å etterligne de fysiologiske forholdene som celler i vevsmiljøet møter2. Det finnes flere forskjellige typer 3D-cellesamlinger som er ansatt, men de to vanligste typene er sfæroider og organoider. Sfæroider kan dyrkes fra mange forskjellige cellelinjer, og de kan vedta forskjellige former og størrelser avhengig av celletypen som brukes og deres samlingsmetode3. Videre kan sfæroider også refereres til som multicellulære tumorsfæroider (MCTS) når de vokser fra kreftcellelinjer, og disse modellene har funnet spesiell bruk for preklinisk in vitro-legemiddellevering og toksisitetsstudier4,5. Organoider, derimot, tar sikte på å bedre etterligne vev og organer i kroppen vår og kan vedta mer komplekse morfologiske ordninger. Produksjonen av organoider innebærer bruk av voksne stamceller eller pluripotente stamceller, som kan omprogrammeres til de aktuelle cellene for å ligne vevet eller orgelet av interesse. De brukes først og fremst til å undersøke utviklingen av organer og for å modellere sykdommer og vertspatogeninteraksjoner6.
Det finnes en rekke forskjellige metoder som brukes til å generere 3D-cellesamlinger. Stillasbaserte metoder gir et substrat eller støtte som celler enten kan feste eller vokse innenfor. Disse stillasene kan ha forskjellige former og kan være laget av en rekke forskjellige materialer. De vanligste er ekstracellulære matrisekomponenter (ECM) og hydrogeler, og de er designet for å ligne det naturlige ekstracellulære miljøet i celler og dermed lette fysiologiske interaksjoner4,7. ECM kjellermateriale er hentet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom svulst og vist seg å inneholde en rik blanding av ECM-komponenter, inkludert laminin, type IV kollagen og perlecan8. Til tross for sin fordelaktige sammensetning er det imidlertid to hovedutfordringer med bruken, nemlig dens batch-til-batch-variasjon og at den har to forskjellige aggregerte tilstander under og over 10 °C8,9. Hydrogeler har derimot fordelen av å være fleksible med hensyn til komponenter og stivhet, og de kan tilpasses den spesifikke 3D-celleenheten ønsket7,10. Stillasbaserte metoder er avgjørende for organoid vekst, men er også mye brukt til sfæroider. Stillasfrie metoder, som fungerer ved å forhindre at celler festes til overflaten de vokser på, er vanligvis bare kompatible med sfæroidmontering. Eksempler er ultra-lave festeplater (ULA), med enten en flat bunn eller U-bunn, som tillater aggregering av cellene i sfæroider, eller bruk av kontinuerlig agitasjon av cellene i spinner / rotasjonsflasker10.
Bruken av 3D-cellesamlinger for å studere et bredt spekter av biologiske hendelser blir raskt stadig mer populært; Det er imidlertid viktig at metoden som er valgt for deres kultur er hensiktsmessig og kompatibel med planene for nedstrømsanalysen. For eksempel genererer bruken av ULA-plater sfæroider med høy konsistens; Denne metoden er imidlertid begrenset til produksjon av en enkelt sfæroid per brønn, og begrenser dermed gjennomstrømningen. Det er særlig hensyn som må tas når fluorescensavbildning av 3D-strukturen planlegges. Underlaget eller platen som enheten dyrkes på, må være optisk kompatibel, og det må tas hensyn til effekten av lysspredning forårsaket av stillaser som kan ha blitt brukt11. Dette spesielle problemet blir mer akutt etter hvert som den numeriske blenderåpningen til mikroskopet objektive linser øker.
Uten tvil er en av hovedårsakene til å velge å jobbe med en 3D-cellemodell å trekke ut volumetriske bildedata om ikke bare hele samlingen, men også de enkelte cellene i den. Spesielt MCTS-modeller begynner å vise seg å være svært kraftige for å utdype vår forståelse av hvordan terapeutiske behandlinger går fra utsiden til sentrale celler (som de trenger i en svulst)12, og derfor er det viktig å få kunnskap fra individuelle celler på forskjellige lag. Bildeteknologien som trekker ut kvantitativ informasjon fra enkeltceller kalles høyinnholdsanalyse (HCA) og er en kraftig tilnærming i sammenheng med screening13. Til dags dato har HCA nesten utelukkende blitt brukt på monolayerkulturer, men det er en økende erkjennelse av at denne tilnærmingen har makt til å bli brukt på 3D-kulturer, slik at et bredt spekter av cellulære funksjoner og prosesser kan studeres14. Det vil ha den klare fordelen at et stort antall 3D-samlinger kan analyseres, og potensielt gi data på cellenivå fra hver struktur. Utfordringer knyttet til avbildning av potensielt tykke cellesamlinger, så vel som de store datasettene som genereres, må imidlertid overvinnes.
I denne artikkelen presenteres en robust stillasbasert metode for storskala produksjon av MCTS i et 96-brønns format. Metoden letter produksjonen av flere hundre 3D-celleenheter i hver brønn. Eksempler er vist for tre forskjellige celletyper, som representerer solide tumormodeller i leveren, lungen og tykktarmen. Sfæroidene som dannes kan være av en rekke størrelser, og derfor brukes HCA til å velge strukturer av en bestemt størrelse og / eller morfologi. Denne funksjonen gir den ekstra fordelen at alle observerte fenotyper kan sammenlignes på tvers av sfæroider av forskjellige størrelser, men alle behandles på samme måte i samme brønn. Denne tilnærmingen er kompatibel med høyoppløselig bildebehandling, og gir viktig både kvantitative data på cellenivå og subcellulært nivå fra de samme cellesamlingene. Denne metoden for sfæroidproduksjon har den ekstra fordelen i forhold til metoder som genererer en enkelt sfæroid per brønn, at det store antallet sfæroider produsert i hver brønn potensielt gir tilstrekkelig biomasse til andre nedstrømsanalyser, for eksempel transkripsjon og proteomprofilering.
Tilnærmingen beskrevet her beskriver en plattform for å generere flere hundre sfæroider per brønn på en måte som passer for HCS og HCA. Sammenlignet med andre populære metoder, for eksempel bruk av flatbunnede og rundbunnede ULA-plater, som tillater dannelse av bare en sfæroid per brønn18,19, gir denne metoden muligheten for at høyoppløselig informasjon kan trekkes ut fra et stort antall sfæroider i et screeningformat. Spesielt har denne metoden blitt…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner støtten fra et forskningsstipend for infrastruktur fra Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) til JCS. Arbeidet i UCD Cell Screening Laboratory støttes av UCD College of Science. ASC er finansiert av en irsk forskningsrådsregjering (IRC) i Irland Postgraduate Scholarship (GOIPG/2019/68). Forfatterne takker også alle medlemmer av laboratoriet for deres innspill og nyttige diskusjoner. Kunstverket i figur 1 ble generert i BioRender.
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |