דגימת דם חוזרת מהווריד הסובקלבי של חולדה מודעת
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לאיסוף דם מהווריד הסובקלאבי בחולדות. הוא מאפשר דגימה מהירה, מהירה וקלה לזיהוי ללא הרדמה ומשיג דם איכותי באמצעות איסוף דגימות חוזר.
Abstract
חולדות נמצאות בשימוש נרחב במחקרים פרמקוקינטיים (PK) וטוקסיקוקינטיים (TK) שצריכים לאסוף כמות מסוימת של דם בנקודות זמן ספציפיות כדי לזהות חשיפה לסמים. שיטת דגימת הדם של חולדות קובעת את איכות הפלזמה ומשפיעה עוד יותר על דיוק תוצאות הבדיקה. שיטת איסוף הדם של הוורידים הסובקלאביים המתוארת בפרוטוקול זה אוספת דגימות דם שוב ושוב במצב המודע של בעלי חיים כדי לענות על הצרכים של בדיקות PK ו- TK. מיומנויות הטיפול בריסון וההליך המתאים של חתך המחט מבטיחים את שיעור ההצלחה של איסוף הדם. זה קל לתפעול תוך הבטחת איכות הפלזמה ובו זמנית קייטרינג רווחת בעלי חיים. עם זאת, שיטה זו דורשת הפעלה מיומנת, ושיטה לא נכונה עלולה לגרום לחולשה של בעלי חיים, כאבים, צליעה ואף תמותה. השיטה הנוכחית שימשה במתקן הבדיקה למחקר רעילות אוראלית בן 4 שבועות בחולדות Sprague Dawley (SD) עם TK. כמות הדם המקסימלית שנאספה תוך 24 שעות לא עלתה על 20% מכלל הדם של החיה. משקל גופם של בעלי החיים היה יותר מ-200 גרם לזכרים ולנקבות. הנתונים הראו כי משקל גופם של בעלי החיים עלה בהתמדה מדי שבוע, והתצפית הקלינית הייתה תקינה לאחר איסוף דגימות חוזר.
Introduction
על פי הנחיות 1 של הוועידה הבינלאומית להרמוניזציה של דרישות טכניות לרישום תרופות לשימוש אנושי (ICH)והנחיות 2 של מנהל המוצרים הרפואיים הלאומי (NMPA), מספר נקודות הזמן לאיסוף הדם של חולדות במחקר הטוקסיקוקינטי (TK) צריך לעמוד בדרישות של הערכת החשיפה הדינמית לתרופות. נפח הדם הכולל המשוער של חולדה הוא 55-70 מ”ל/ק”ג משקל גוף3. נקודות זמן האיסוף הן בדרך כלל אינטנסיביות תוך 30 דקות לאחר המינון ויורדות לאחר מכן, ויש לאסוף יותר מעשר דגימות דם תוך 48 שעות בבדיקות שגרתיות4. לדוגמה, דגימות דם נאספות ב -12 נקודות זמן (0 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 דקות, 1 שעות, 2 שעות, 3 שעות, 4 שעות, 8 שעות ו -12 שעות) במחקר TK של תרופות הניתנות דרך הפה. חוקרים חייבים לאסוף שוב ושוב 200-250 μL של דם בחולדות כדי לקבל פלזמה באיכות גבוהה עבור בדיקת TK5.
אתרי איסוף הדם בחולדות כוללים כלי דם זנב, וריד מקלעת רטרו-אורביטלי, וריד תת-לסתני, לב, אבי עורקים בטני6 וכן הלאה. ביניהם, איסוף דם מן הווריד הקאודלי של חולדות היא שיטה נפוצה, אשר דורש מפעילים מנוסים ומיומנים 7,8. כדי לאסוף דם מן הווריד מקלעת רטרו מסלולית הוא פחות מסובך; עם זאת, שיטה זו אינה מומלצת מכיוון שהיא עלולה לפגוע בראייה של החולדות9, ודם מהלב ומאבי העורקים הבטני מתאים רק לדגימת דם סופית10. שיטה נוספת לאיסוף דם מהווריד התת-לסתי בחולדה מודעת הוכחה כגורמת לסיבוכים רבים יותר וחשפה איכות דגימת דם לא מספקת11. לכן, החוקרים עשויים להרדים את בעל החיים כדי להפחית את הקושי בדגימה. עם זאת, ההרדמה גם מייקרת את עלות הניסוי, וחמור מכך, היא תשפיע על המצב המטבולי של חולדות12. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשיטה מהירה ופשוטה של איסוף דם בוורידים התת-צלביים של חולדות ללא הרדמה, ומאפשר מיקום מדויק ואיסוף דם לסירוגין דו-צדדי כדי לקבל דגימות באיכות גבוהה בזמן ובאופן חוזר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם יתרונות מסוימים של איסוף דם מן הוורידים subclavian. (1) מכיוון שאתר איסוף הדם מנותק בקלות, ומקלעת הוורידים אינה סדירה בשל התנוחות השונות של החולדות, השיטה המתוארת יכולה בקלות למקם את מיקום המקלעת הוורידית תוך שמירה על התנוחות היציבות והנוחות של החולדות. (2) הניתוח קל ונוח לפיתוח מהיר של כישו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג להערכה ומחקר לא קליניים של תרופות (No.2018B030323024) ותוכנית המפתח “יצירת תרופות חדשות” של תוכנית המחקר והפיתוח של מפתח גואנגדונג (No.2019B020202001), פרויקט המחקר של קרן היסוד והיישום של גואנגזו (No.202002030249 ו- No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referências
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
