Gentagen blodprøvetagning fra den subklaviske vene hos bevidst rotte
Summary
Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til indsamling af blod fra den subklaviske vene hos rotter. Det muliggør hurtig, rettidig og let identificerbar prøveudtagning uden bedøvelse og opnår blod af høj kvalitet gennem gentagen prøveindsamling.
Abstract
Rotter anvendes i vid udstrækning i farmakokinetiske (PK) og toksikokinetiske (TK) undersøgelser, der skal indsamle en vis mængde blod på bestemte tidspunkter for at detektere lægemiddeleksponering. Rotteblodprøvetagningsmetoden bestemmer plasmaets kvalitet og påvirker yderligere præcisionen af testresultaterne. Den subklaviske veneblodindsamlingsmetode, der er beskrevet i denne protokol, indsamler blodprøver gentagne gange i dyrs bevidste tilstand for at imødekomme behovene hos PK- og TK-test. Færdighederne i fastholdelseshåndtering og passende procedure for nålesnit sikrer succesraten for blodindsamling. Det er let at betjene, samtidig med at plasmakvaliteten sikres, og samtidig tages der hensyn til dyrevelfærd. Denne metode kræver dog dygtig betjening, og en forkert metode kan forårsage svaghed hos dyr, smerte, halthed og endda dødelighed. Den nuværende metode er blevet anvendt i testfaciliteten til et 4-ugers oralt toksicitetsstudie i Sprague Dawley (SD) rotter med TK. Den maksimale mængde blod indsamlet inden for 24 timer oversteg ikke 20% af dyrets samlede blod. Dyrenes kropsvægt var mere end 200 g for mænd og kvinder. Dataene viste, at dyrenes kropsvægt steg støt hver uge, og den kliniske observation var normal efter gentagen prøveindsamling.
Introduction
Ifølgeretningslinjerne fra International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) 1 og National Medical Products Administration (NMPA) guidelines2 skal antallet af tidspunkter for indsamling af blod fra rotter i den toksikokinetiske undersøgelse (TK) opfylde kravene i den dynamiske lægemiddeleksponeringsvurdering. Det omtrentlige totale blodvolumen af en rotte er 55-70 ml / kg legemsvægt3. Opsamlingstidspunkterne er generelt intensive inden for 30 minutter efter dosering og falder derefter, og mere end ti blodprøver skal indsamles inden for 48 timer i rutinemæssig test4. For eksempel indsamles blodprøver på 12-tidspunkter (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 time, 2 h, 3 timer, 4 timer, 8 timer og 12 timer) i TK-undersøgelse af oralt administrerede lægemidler. Forskere skal gentagne gange indsamle 200-250 μL blod i rotter for at opnå plasma af høj kvalitet til TK-testen5.
Blodindsamlingsstederne hos rotter omfatter haleblodkar, retro-orbital plexusvene, submandibulær vene, hjerte, abdominal aorta6 og så videre. Blandt dem er blodindsamling fra den kaudale vene hos rotter en hyppigt anvendt metode, som kræver erfarne og dygtige operatører 7,8. At indsamle blod fra retro-orbital plexusvenen er mindre kompliceret; Denne metode anbefales dog ikke, da den kan skade rotternes syn9, og blod fra hjertet og abdominal aorta er kun egnet til endelig blodprøvetagning10. En anden metode til indsamling af blod fra den submandibulære vene hos en bevidst rotte har vist sig at resultere i flere komplikationer og afslørede utilstrækkelig blodprøvekvalitet11. Derfor kan forskere bedøve dyret for at reducere vanskeligheden ved prøveudtagning. Alligevel øger anæstesien også omkostningerne ved eksperimentet, og mere alvorligt vil det påvirke metabolisk tilstand hos rotter12. Denne protokol bruger en hurtig og ligetil metode til indsamling af blod i de subklaviske vener hos rotter uden bedøvelse, hvilket muliggør nøjagtig positionering og bilateral alternerende blodindsamling for at opnå prøver af høj kvalitet rettidigt og gentaget.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er visse fordele ved at indsamle blod fra de subklaviske vener. (1) Da stedet for blodtapningen let adskilles, og venøs plexus ikke er regelmæssig på grund af rotternes forskellige stillinger, kan den beskrevne metode let lokalisere placeringen af venøs plexus, samtidig med at rotternes stabile og behagelige stillinger opretholdes. (2) Operationen er let og gunstig for den hurtige udvikling af teknikernes færdigheder og mindre smerte for dyr. (3) En driftstilstand, der gør dyret behageligt, reducerer rastløs a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) og Key Program “New Drug Creation” af Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 og No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referências
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
