वर्तमान प्रोटोकॉल पुन: प्रयोज्य एकल सेल का उपयोग करके पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए एक एकल-कोशिका विधि का वर्णन करता है। पुन: प्रयोज्य एकल कोशिका एक ही कोशिका में कई एपिजेनेटिक चिह्नों के विश्लेषण और परिणामों के सांख्यिकीय सत्यापन की अनुमति देती है।
वर्तमान एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण एकल उपयोग के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। एकल उपयोग के बाद सेल को त्याग दिया जाता है, एक एकल सेल में कई एपिजेनेटिक चिह्नों के विश्लेषण को रोकता है और एकल सेल में प्रयोगात्मक पृष्ठभूमि शोर से सिग्नल को अलग करने के लिए अन्य कोशिकाओं से डेटा की आवश्यकता होती है। यह पेपर पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए एक ही एकल कोशिका का पुन: उपयोग करने की एक विधि का वर्णन करता है।
इस प्रयोगात्मक विधि में, सेलुलर प्रोटीन को पहले प्रोटीन और डीएनए से क्रॉसलिंक करने के बजाय पॉलीक्रिलामाइड बहुलक में लंगर डाला जाता है, जिससे संरचनात्मक पूर्वाग्रह कम होता है। यह महत्वपूर्ण कदम एक ही एकल कोशिका के साथ बार-बार प्रयोगों की अनुमति देता है। इसके बाद, निकटता बंधाव के लिए एक मचान अनुक्रम के साथ एक यादृच्छिक प्राइमर को जीनोमिक डीएनए में लगाया जाता है, और जीनोमिक अनुक्रम को डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके विस्तार से प्राइमर में जोड़ा जाता है। इसके बाद, एक एपिजेनेटिक मार्कर और नियंत्रण आईजीजी के खिलाफ एक एंटीबॉडी, प्रत्येक को अलग-अलग डीएनए जांच के साथ लेबल किया जाता है, एक ही एकल कोशिका में संबंधित लक्ष्यों से बंधे होते हैं।
यादृच्छिक प्राइमर और एंटीबॉडी-डीएनए जांच के मचान अनुक्रम में पूरक अनुक्रमों के साथ एक कनेक्टर डीएनए जोड़कर यादृच्छिक प्राइमर और एंटीबॉडी के बीच निकटता बंधाव को प्रेरित किया जाता है। यह दृष्टिकोण निकटता बंधाव के एकल डीएनए उत्पाद में एंटीबॉडी जानकारी और आस-पास के जीनोम अनुक्रमों को एकीकृत करता है। एक ही एकल सेल के साथ बार-बार प्रयोगों को सक्षम करके, यह विधि एक दुर्लभ सेल से डेटा घनत्व में वृद्धि और एक ही सेल से केवल आईजीजी और एंटीबॉडी डेटा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देती है। इस विधि द्वारा तैयार पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को कम से कम कुछ महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में एपिजेनेटिक लक्षण वर्णन को व्यापक बनाने और डेटा घनत्व बढ़ाने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। यह विधि शोधकर्ताओं और उनकी परियोजनाओं को लचीलापन प्रदान करती है।
सिंगल-सेल तकनीक सिंगल-सेल मल्टीओमिक्स के युग में प्रवेश कर रही है, जो व्यक्तिगत एकल-सेल ओमिक्सप्रौद्योगिकियों को एकीकृत करती है। हाल ही में, एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स को क्रोमैटिन पहुंच (एससीएनएमटी-सेक2 और शेयर-सेक3) या हिस्टोन संशोधनों (युग्मित-सेक4 और युग्मित-टैग5) का पता लगाने के तरीकों के साथ जोड़ा गया है। हाल ही में, एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स को क्रोमैटिन पहुंच (डोगमा-सेक6) के साथ एकीकृत किया गया था। ये विधियां क्रोमैटिन पहुंच या हिस्टोन संशोधनों का पता लगाने के लिए ट्रांसपोसेस-आधारित टैगिंग का उपयोग करती हैं।
ट्रांसपोसेस-आधारित दृष्टिकोण जीनोमिक डीएनए को छोड़ देते हैं और जीनोमिक डीएनए टुकड़े के अंत में एक डीएनए बारकोड जोड़ते हैं। प्रत्येक क्लीवर जीनोमिक टुकड़ा केवल दो डीएनए बारकोड (= एक एपिजेनेटिक मार्क प्रति दरार साइट) तक स्वीकार कर सकता है, और दरार साइट पर जीनोमिक डीएनए खो जाता है। इसलिए, क्लीवेज-आधारित दृष्टिकोणों में परीक्षण किए गए एपिजेनेटिक निशान की संख्या और सिग्नल घनत्व के बीच एक व्यापार-बंद है। यह एक ही कोशिका में कई एपिजेनेटिक निशान के विश्लेषण में बाधा डालता है। एक एकल-कोशिका एपिजेनोमिक विधि जो जीनोमिक डीएनए को नहीं छोड़ती है,इस मुद्दे को दूर करने के लिए विकसित की गई थी।
ऊपर उल्लिखित दरार-व्युत्पन्न मुद्दे के अलावा, ट्रांसपोसेज़-आधारित दृष्टिकोणों की अन्य सीमाएं हैं। एकल-कोशिका एपिजीनोम विश्लेषण में, जीनोम पर हिस्टोन और डीएनए से जुड़े प्रोटीन के स्थान को जानना महत्वपूर्ण है। वर्तमान दृष्टिकोण ों में, यह अनिर्धारित एकल कोशिकाओं का उपयोग करके और प्रोटीन-डीएनए और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रतिधारण द्वारा पूरा किया जाता है। हालांकि, यह सुलभ क्रोमैटिन क्षेत्रों के लिए मजबूत पूर्वाग्रह उत्पन्न करता है, यहां तक कि हिस्टोन संशोधनों के विश्लेषण में भी। जीनोम पर हिस्टोन और जीनोम से जुड़े प्रोटीन के स्थान को क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन-डीएनए और प्रोटीन-प्रोटीन के बिना संरक्षित किया जा सकता है, एक पॉलीक्रिलामाइड मचान 7,8 का उपयोग करके। यह दृष्टिकोण वर्तमान दृष्टिकोणों में देखे गए संरचनात्मक पूर्वाग्रह को कम करता है जो प्रोटीन-डीएनए और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर निर्भर करता है।
ट्रांसपोसेस-आधारित दृष्टिकोण एक ही सेल से केवल एक बार संकेत प्राप्त कर सकते हैं। इसलिए, संकेतों के ड्रॉप-ऑफ के कारण एकल कोशिका के पूर्ण एपिजीनोम को चित्रित करना मुश्किल है। एक ही एकल कोशिका में पुनरावृत्ति एपिजेनोमिक विश्लेषण की अनुमति देकर वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए पुन: प्रयोज्य एकल कोशिकाओं को विकसित किया गया है।
यह आलेख पुन: प्रयोज्यएकल कोशिकाओं 7 का उपयोग करके हाल ही में रिपोर्ट किए गए एकल-सेल मल्टीएपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। बाद के पैराग्राफ में, हम प्रोटोकॉल मे?…
The authors have nothing to disclose.
हम परियोजना के अवधारणा चरण के दौरान टिप्पणियों के लिए डॉ डेविड सांचेज-मार्टिन और क्रिस्टोफर बी बक को धन्यवाद देते हैं। हम प्रारंभिक प्रयोगों में मदद के लिए जीनोमिक्स कोर, सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च, नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण में सलाह के लिए सहयोगी जैव सूचना विज्ञान संसाधन, सीसीआर, एनसीआई, एनआईएच को भी धन्यवाद देते हैं। हम विधि में उपयोग किए जाने वाले डीएनए पोलीमरेज़ के अनुकूलन में मदद करने के लिए सुश्री अन्ना वर्ड को धन्यवाद देते हैं। इस काम ने एनआईएचएचपीसी बायोवुल्फ क्लस्टर (http://hpc.nih.gov) के कम्प्यूटेशनल संसाधनों का उपयोग किया। यह परियोजना सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च, नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, एनसीआई डायरेक्टर इनोवेशन अवार्ड (# 397172) के इंट्राम्यूरल प्रोग्राम और अनुबंध संख्या एचएचएसएन 261200800001ई के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से संघीय धन द्वारा समर्थित है। टॉम मिस्टली, कैरोल थिएले, डगलस आर लोवी, और सेलुलर ऑन्कोलॉजी प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को उत्पादक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद।
10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |