Analyse af interaktionen mellem fluorescerende mærkede proteiner med kunstige fosfolipidmikrovesikler ved hjælp af kvantitativ flowcytometri
Summary
Her beskriver vi et sæt metoder til karakterisering af interaktionen mellem proteiner og membraner af celler eller mikrovesikler.
Abstract
I menneskekroppen fortsætter de fleste af de vigtigste fysiologiske reaktioner, der er involveret i immunresponset og blodkoagulationen, på cellernes membraner. Et vigtigt første skridt i enhver membranafhængig reaktion er binding af protein på fosfolipidmembranen. En tilgang til at studere proteininteraktion med lipidmembraner er udviklet ved hjælp af fluorescerende mærkede proteiner og flowcytometri. Denne metode tillader undersøgelse af protein-membran interaktioner ved anvendelse af levende celler og naturlige eller kunstige phospholipid vesikler. Fordelen ved denne metode er enkelheden og tilgængeligheden af reagenser og udstyr. I denne metode mærkes proteiner ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Imidlertid kan både selvfremstillede og kommercielt tilgængelige, fluorescerende mærkede proteiner anvendes. Efter konjugering med et fluorescerende farvestof inkuberes proteinerne med en kilde til phospholipidmembranen (mikrovesikler eller celler), og prøverne analyseres ved flowcytometri. De opnåede data kan bruges til at beregne de kinetiske konstanter og ligevægt Kd. Derudover er det muligt at estimere det omtrentlige antal proteinbindingssteder på fosfolipidmembranen ved hjælp af specielle kalibreringsperler.
Introduction
Biomembraner adskiller det indre indhold af dyreceller og ekstracellulært rum. Bemærk, at membraner også omgiver mikrovesikler dannet under cellens livscyklus og organeller. Cellemembranen består overvejende af lipider og proteiner. Membranproteiner udfører signal-, struktur-, transport- og klæbefunktioner. Lipiddobbeltlaget er imidlertid også afgørende for sammenhængen mellem dyrecellen og det ekstracellulære rum. Dette papir foreslår en metode til undersøgelse af den perifere interaktion mellem eksterne proteiner og lipidmembranen.
Det mest slående eksempel på reaktioner, der forekommer på det ydre membranlag af en dyrecelle, er blodkoagulationsreaktionen. Et vigtigt træk ved blodkoagulation er, at alle hovedreaktioner fortsætter på fosfolipidmembranerne i celler og mikrovesikler, der stammer fra disse celler og ikke i plasma 1,2,3. Membranafhængige reaktioner indbefatter processen med at starte koagulation (på cellemembranerne i subendotelet, betændt endotel eller aktiverede immunceller med deltagelse af en vævsfaktor), alle reaktioner af hovedkaskadeaktivering af faktorer IX, X, protrombin; aktivering af faktor XI med thrombin (på membranerne i aktiverede blodplader, erythrocytter, lipoproteiner og mikrovesikler); reaktioner af protein C-vejen; inaktivering af koagulationsenzymer (på membranerne i endotelceller med deltagelse af trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-receptor, heparansulfat); og kontaktvejsreaktioner (på membraner af blodplader og nogle mikrovesikler med deltagelse af ukendte cofaktorer). Det er således umuligt at undersøge blodkoagulation uden at studere interaktionen mellem forskellige plasmaproteiner og blodcellernes membran.
Dette papir beskriver en flow-cytometribaseret metode til karakterisering af interaktionen mellem proteiner og lipidmembraner i celler eller mikrovesikler. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt foreslået for at studere interaktionen mellem blodplasma og blodplader og kunstige fosfolipidvesikler. Desuden interagerer de fleste af de undersøgte proteiner direkte med negativt ladede membranphospholipider, især med phosphatidylserin 4,5. Derudover er der proteiner, hvis interaktion med membranen medieres af specielle receptorer6.
En vigtig evne til flowcytometri er at skelne mellem frie og bundne ligander uden yderligere adskillelse. Denne funktion af cytometri tillader undersøgelse af ligandligevægtbinding ved slutpunktet og hjælper med at udføre kontinuerlige kinetiske målinger. Teknikken er usofistikeret og kræver ikke kompleks prøveforberedelse. Flowcytometri bruges aktivt til kvantitativt at studere dynamikken i interaktion mellem fluorescerende peptider, receptorer og G-proteiner i intakte og vaskemiddelgennemtrængelige neutrofiler7. Denne tilgang kan også anvendes til udforskning af protein-DNA-interaktioner og kinetikken af endonukleaseaktivitet i realtid8. Over tid blev denne metode brugt til kvantitativt at studere protein-proteininteraktioner med høj affinitet med oprensede lipidvesikler9 eller mere generelt med membranproteiner udtrykt i et meget effektivt Sf9-celleekspressionssystem10. Kvantitative metoder er også blevet beskrevet til karakterisering af protein-liposominteraktioner ved anvendelse af flowcytometri til transmembranproteiner11.
Denne teknik bruger selvfremstillede kalibreringsperler for at undgå at bruge kommercielt tilgængelige perler7. Kalibreringsperlerne, der blev brugt tidligere7 , var beregnet til at arbejde med fluorescein, hvilket væsentligt begrænsede sortimentet af tilgængelige fluorescerende ligander på proteinerne. Derudover tilbyder dette papir en ny måde at erhverve og analysere kinetiske data til rimelig tidsopløsning. Selvom denne metode er beskrevet for kunstige fosfolipidvesikler, er der ingen åbenlyse begrænsninger for dens tilpasningsevne til celler, naturlige vesikler eller kunstige fosfolipidvesikler med en anden lipidsammensætning. Metoden beskrevet heri tillader estimering af parametrene for interaktion (kon, koff) og ligevægt (Kd) og letter kvantitativ karakterisering af antallet af proteinbindingssteder på membranen. Bemærk, at denne teknik giver et omtrentligt skøn over antallet af bindingssteder. Fordelene ved metoden er dens relative enkelhed, tilgængelighed og tilpasningsevne til indfødte celler og naturlige og kunstige mikrovesikler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreslåede metode kan tilpasses til en grov karakterisering af interaktionen mellem proteiner og fosfolipidmembraner fra forskellige kilder og sammensætninger. Den kvantitative flowcytometri, der er beskrevet her, indrømmer overfladeplasmonresonans (SPR) i flere parametre. Det har især en lavere følsomhed og tidsopløsning og kræver fluorescerende mærkning af proteiner. Fluorescerende mærkning kan føre til en ændring i konformation og tab af aktivitet for mange proteiner og kræver derfor omhyggelig kontrol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne blev støttet af et russisk videnskabsfondstilskud 20-74-00133.
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, 32-38 (2006).
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF – Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
